细胞复苏步骤和注意事项
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下:1、细胞复苏:细胞培养条件2、复苏流程:(1)确认水浴锅的水清洁可用,方可提前打开37度预热。
(2)确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置,并做好复苏登记。
(3)提前做好复苏准备,预热培养基。
(4)悬浮和贴壁细胞复苏参数:(5)将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解,1.8ml时间大概1分30秒,1ml大概1min左右,需计时,其间不要老是拿起来观察,需要快速复溶,避免细胞受到损伤。
(6)贴壁细胞需离心,1000rpm,5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中(7)贴壁细胞离心后去除上清,用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶,蕞后放入培养箱中培养。
(8)取小样计数观察,细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好,需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1.悬浮细胞传代流程:(1)先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出,用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
(2)打开摇瓶瓶盖,用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中,瓶盖过火,拧紧,将培养瓶放回摇床。
(3)将200ul细胞混匀,取10ul细胞加入10ul台盼蓝,显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
(4)细胞需计数两次求平均值。
(5)悬浮细胞生长参数(6)根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例:细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml,此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下:计算:需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中,放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程:(1)显微镜下观察细胞状态和密度,80%汇合率以上需要传代。
(2)T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液(需37度预热),使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正)进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-30分钟。
紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制:配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加)2.细胞复苏:将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
(将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清,然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内,再加入4ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
)3.细胞换液:复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。
贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次,每次3-5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞复苏步骤和注意事项
细胞复苏步骤和注意事项
细胞复苏步骤与注意事项
细胞复苏是一种常用的技术,它能够重现细胞衰老和逆转部分死亡细胞状态,
从而使细胞可持续繁殖。
随着科技的进步,细胞复苏技术越来越受到重视,在许多生物研究中发挥着重要作用,因而也引起了广泛的关注。
基本的细胞复苏步骤:
(1)首先需要准备适当的文献和材料,并准备必要的实验仪器和设备;
(2)根据实验需要,从文献中收集和研究细胞恢复需要考虑的因素以及恢复过程
中可能产生的影响;
(3)绘制实验方案,以确定实验操作步骤;
(4)使用采集到的实验材料,在实验室中进行实验,按照设计的步骤进行细胞恢复;
(5)观察细胞复苏的结果,收集有用的数据,并使用相应的统计学方法进行分析;(6)根据实验结果作出建议,将细胞复苏结果应用到其他实验中;
(7)清理实验室,归还实验器材。
在细胞复苏过程中,必须遵守以下几项重要的注意事项:
(1)严格控制实验环境,确保细胞能够在适当的温度、湿度、PH值和光照条
件下正常活动;
(2)细胞恢复时,必须严格控制使用媒介的成分,细胞应处于其最适宜的环境中;(3)实验中应密切关注细胞的生长行为,以防细胞活力不足或出现异常反应;(4)细胞复苏过程中应注意动物实验的实施程序,避免实验过程中动物受到不良
影响;
(5)注意不同类型的细胞之间存在的差异,应根据细胞的特性,制定适合本型细
胞的实验操作步骤;
(6)细胞恢复实验有关的仪器和器材应注意保持清洁,同时务必保存实验记录,
以备以后参考;
(7)实验结束后,应行为有序,收好实验器材,并将实验记录收集整理,以备下
次使用。
细胞复苏是一种繁琐的技术。
细胞复苏步骤和注意事项
细胞复苏步骤和注意事项细胞复苏步骤注意事项:【材料】1. 常规细胞培养仪器设备恒温水浴振荡器。
2. 培养液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亚砜(DMSO)【操作程序】1. 细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
2. 培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱370C预热20min,备用。
3. 二甲基亚砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,备用。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400C水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。
6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。
7. 记录复苏日期。
【注意事项】1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。
此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2. 冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作较大,因此,必须在1-2min 内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题:目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。
因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大,死亡。
此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液体前倒净,且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤:
1:从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入37度水浴中,一般用烧杯倒入蒸馏水,然后放入水浴锅中预热,防止水浴锅中水污染细胞,将冻存管竖起,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
2:将细胞悬液移入离心管,缓慢加入4ml 培养液,离心1000转每分钟,离五分钟。
3:将离心后的上清液吸出,加入PBS 清洗一下细胞,减少DMSO 对细胞的毒性作用,缓慢捶打均匀,然后离心。
4:将上清吸出,用培养液混匀沉淀的细胞,调整细胞密度,将细胞悬液吸入培养瓶中,再加入新的培养液培养,等细胞贴壁后即换液,以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤:
1:将细胞从培养瓶上消化下来,然后加入培养液,混匀后计数,要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2:然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中,离心
3:将上面液体吸走,然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4:冻存液的配制,1ml ;600ul10%DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ,
5:然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中,冻存,先放入4度冰箱中,然后再放入-20度,最后放入液氮中保存。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程:
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出,立即放入37°C的水浴中进行融化,轻柔晃动,加速融化,直到小瓶中只剩下一小块冰,时长应控制在1min 中;
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中,打开瓶盖前,用酒精灯火焰对瓶口进行消毒;
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中,加入适量浓度和体积的完全培养基,轻柔混合均匀;
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清,加入新鲜完全培养基重悬细胞,并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项:
1、液氮温度低,小心低温对人造成的伤害,在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险,因此,取出冻存管的时候,要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中,取出时应迅速,避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术,简而言之就是快融,将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时,冻存管先放入无菌一次性PE手套中,再放入水中融化,避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后,在培养皿中培养时,应尽量维持高密度,以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作,避免细胞发生污染。
细胞复苏
我们公司最近在做细胞的过程中,出现了复苏细胞时冻存管爆炸的现象,不知道各位站友有没有遇到过,在此,我想就细胞冻存及复苏的一些规范与大家分享一下:
1 在细胞冻存的时候务必将冻存管拧紧!
2.细胞复苏操作步骤:
2.1 将培养基置于37℃回温,回温后将其用75%酒精擦拭,移入无菌操作台内;
2.2 戴上护目镜,厚毛线手套之后,从液氮罐中取出细胞冷冻管。
若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留的液氮,之后拧紧冻存管,放入37-40℃水浴中,并不时摇动,使其迅速融化,以足量75%酒精擦拭之,转移到已加入10ml培养液的离心管内;
2.3 在1,000 rpm下离心5~10分钟,弃去上清液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,置5% CO2温箱静置培养;
2.4 次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。
若细胞密度较高,及时传代;否则,及时更换培养基继续培养。
3.细胞复苏注意事项:
3.1 复苏细胞请一定要注意安全,尤其是来自客户的细胞。
在放入液氮容器之前就应该检查冻存管是否拧紧。
取出复苏时若有液氮进入,请一定要拧松冻存管,排出液氮,防止温度升高时爆炸。
3.2 细胞复苏时需使用指定培养液。
绝大多数细胞均无法立即适应不同基础培养基或不同的血清种类,若因实验需要,必须有所不同,须以缓慢比例渐次改变培养基组成,确定细胞适应后,方进行实验。
3.3 细胞复苏时可以暂时不使用抗生素(G418等),以利于细胞的恢复。
3.4 细胞复苏前需检查恒温水浴锅的温度是否已经适宜。
细胞复苏实验指导
细胞复苏细胞复苏是将休眠的细胞重新活化,使之重新生长,进入细胞周期,进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后,可进入细胞周期,重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前,将无菌培养瓶,15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台,以紫外线照射30min。
然后,采用通风机通风3min。
以75%酒精擦拭操作台和双手。
准备好冰盒。
将离心机调节至800rpm,5min。
水浴箱调节至37度恒温。
取细胞完全培养基,放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。
实验前备冰盒,快速由液氮中取出冻存的细胞,置于冰盒内。
然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,注意管口处高于水面,以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内,以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞,约1min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精喷拭冻存管的外壁,立即拿入超净台内。
二、制备细胞悬液以无菌枪头吸取细胞冻存液,置于已放入细胞完全培养基的离心管中,上下吹打5次,使冻存液与完全培养基充分混匀,尽量减少冻存液中DMSO的浓度,减轻细胞损伤。
以封口膜封好管口。
配平离心:采用天平配平两端,800rpm,室温离心5min。
三、细胞计数采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。
加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中,加入100ul细胞悬液,颠倒混匀三次,可进行细胞计数。
可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方.四、细胞培养离心后,吸弃上清液,不要吸到底部的细胞沉淀。
根据计数结果,向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基,反复吹打制成细胞悬液,吹打过程中尽量不要产生气泡。
符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,左右轻轻摇动培养瓶,把细胞摇均匀,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱中培养,2-4小时或者24-48小时后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定,一般以大部分细胞状态良好时换液为宜,比如超过半数的细胞贴壁,即可换液。
细胞复苏的步骤
细胞复苏的步骤Document number:WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作,可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
一、细胞冷冻保存1、材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法:(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。
细胞复苏方法及要点
细胞复苏方法及要点一、准备所需工具和试剂在进行细胞复苏之前,需要准备以下工具和试剂:1. 冷冻细胞存储容器和液氮罐。
2. 37℃恒温水浴或复苏加热板。
3. 显微镜和细胞计数板。
4. 无菌的离心管、吸管和培养皿。
5. 无菌的细胞培养基和胎牛血清。
6. 无菌的PBS缓冲液或生理盐水。
7. 胰蛋白酶、EDTA或其它细胞分离消化试剂。
8. 无菌的细胞培养箱或孵育设备。
二、确认细胞状态良好在进行细胞复苏之前,需要确认细胞状态良好,包括细胞活性、数量和质量等方面。
可以通过显微镜观察细胞的形态、生长和繁殖情况,以及使用细胞计数板对细胞数量进行统计。
三、将细胞从冷冻容器中取出将冷冻细胞存储容器从液氮罐中取出,迅速将盖子打开,用无菌的吸管或注射器将细胞悬浮液吸出,并加入到无菌的离心管中。
注意不要让细胞沉淀在容器底部,以免影响细胞复苏效果。
四、用适当温度的复苏溶液洗涤细胞将无菌的复苏溶液加入到离心管中,轻轻摇动以混合均匀。
将混合液转移到无菌的培养皿中,用显微镜观察细胞的溶解情况。
如果细胞尚未完全溶解,可以轻轻搅拌或用吸管吹打均匀。
注意复苏溶液的温度要适当,以避免对细胞产生伤害。
五、离心去除复苏溶液将含有细胞的混合液转移到无菌的离心管中,进行离心分离。
离心速度和时间需要根据细胞的类型和状态进行适当调整。
去除上清液后,加入适量的新鲜细胞培养基,轻轻摇动以混合均匀。
六、用新鲜的细胞培养基重新悬浮细胞将重新悬浮的细胞转移到无菌的培养皿中,用显微镜观察细胞的生长和繁殖情况。
如果细胞贴壁生长,可以使用胰蛋白酶或EDTA进行消化分离,并重新悬浮到新鲜的细胞培养基中。
注意细胞浓度要适中,以避免细胞过度生长或竞争性抑制。
七、转移细胞至培养容器中将重新悬浮的细胞转移到无菌的培养容器中,包括细胞瓶、孔板或微孔板等。
根据需要设置不同的细胞浓度和培养条件,如温度、湿度、CO2浓度等。
注意培养容器的盖子要拧紧,以避免污染。
八、将细胞培养在适当的环境下将培养容器转移到无菌的培养箱或孵育设备中,保持适当的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存:一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里,细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。
今天呀,我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿,这里面的门道可多着呢,就像走钢丝,容不得半点马虎。
一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一:前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前,得把“战场”布置好。
先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍,就像给它做个全面的SPA,确保里面一尘不染。
接着,打开水浴锅,把水温调到37℃,这温度可不能出差错,多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了,少一度就像是在冷水里打哆嗦,都不利于细胞恢复生机。
准备好相应的培养液,这就像是细胞的“营养套餐”,没它细胞可活不下去。
步骤二:复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候,感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。
那冻存管冻得直冰手,得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻,要不停地轻轻晃动,就像是在鼓励细胞:“小宝贝们,快快醒来啊!”这时候心里默默祈祷着,可别出啥岔子。
在小细胞们还迷糊着的时候,把它们转移到含有培养液的离心管里,离心的过程又像一场小小的筛选,把那些还没适应过来的杂质去除,留下顽强的细胞。
最后把细胞接种到培养瓶里,就像给它们安家落户啦,盼着它们在新家里茁壮成长。
二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一:选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。
一般是包括培养液、血清和保护剂(像是二甲基亚砜这类的神奇物质)。
血清就像保护层里的柔软衬里,给细胞温暖的呵护,而保护剂则像坚韧的外壳,防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。
这三者的比例得拿捏得死死的,就像厨师做菜时放盐的量,多一点少一点都不行。
步骤二:缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里,标记好细胞类型、日期等信息,这就好比给细胞上户口,省得以后找不到“人”。
然后要进行程序降温。
想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物,得一步步慢慢适应越来越冷的环境。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
9.盖上盖子,倒置显微镜下观察,之后标明名称和日期, 酒精棉球擦瓶口和瓶身,放入培养箱内即可。
注意:
1.打开培养箱时尽量不要说话; 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时,应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出,拧紧盖子; 2.观察瓶内培养基的颜色,是否浑浊等;放在
3.放入超净工作台内,点燃酒精灯,拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒。
4.取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口;
5.拿出PBS瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将 塞子取出,烧瓶口(至少10圈)。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS,打入培养瓶内。烧培养 瓶口,来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
4. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口;
5. 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将 塞子取出,烧瓶口(至少10圈)。
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6.用吸管吸取3ml的PBS,打入培养瓶内。烧培养瓶口, 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。
7.拿出培养基瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将塞子取出, 烧瓶口(至少10圈)。
11.拿到工作台内,烧瓶口,取下盖子,烧瓶 口。用吸管吸出胰酶,烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子 将塞子取出,烧瓶口(至少10圈)。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内, 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数,分装 即可。
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冻存
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出,拧紧盖子;
2.观察瓶内培养基的颜色,是否浑浊等;放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。
细胞复苏的步骤
细胞冻存的实验步骤这是我的实验记录,经过实践检验的,成功率很高。
1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天最好换液2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶,加入1.5ml新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。
5. 去上清液,加入与1ml的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
注意事项(个人总结):1.细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染;2.冻存用90%的胎牛血清或者进口血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力3.一定要保证DMSO的浓度是10%,冻细胞要舍得用进口的DMSO(我用的是SIGMA)4.慢冻,快解冻。
细胞在-15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤最大,缓慢降温有助于减少损伤,故放入-20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便,保存时间过久会影响细胞活力细胞复苏的实验步骤主要器材:一次性滴管、打火机、酒精灯、大镊子、中镊子、记号笔、废液缸、封口膜、剪子。
主要试剂:PBS、培养液、消化酶(胰酶)、75%酒精、双抗。
PBS配制:NaCL :4g KCL:0.1g Na2HPO4 :1.745g KH2PO4:0.1g 三蒸水:500mL,溶解后高压灭菌。
培养基配制:5mL双抗、50mL血清,加入培养基中。
细胞复苏步骤:1、水浴锅打开,调到35.8°C~37°C。
细胞复苏的步骤
细胞复苏的步骤细胞复苏是一种非常重要的生物学过程,涉及到多个步骤,其中包括细胞代谢的重新启动、细胞膜的重组,以及细胞内外环境的平衡调节等。
下面我将详细介绍细胞复苏的步骤,希望能够为您提供参考。
第一步:保护细胞在细胞受到外界刺激或胁迫后,为了保护细胞不受继续损伤,克服并消除侵袭性环境的影响以及炎性反应的发生将是第一步。
细胞膜紧张、细胞质脱水、细胞内外离子平衡的改变等是细胞受刺激时的典型表现。
因此,必须采取适当的手段,如洗涤、稀释、加水、添加保护剂等,保护细胞,使其免受继续的刺激和损伤。
第二步:重新启动代谢在细胞受到严重的损伤后,代谢和能量供应将受到影响。
因此,重新启动代谢和供能过程是非常重要的步骤。
在这个过程中,细胞需要恢复并重新启动蛋白质、核酸和其他生化反应的过程。
这个过程中,通常需要将包括糖、氨基酸、核苷酸等有机物质的组合物提供给细胞,帮助其维持生命活动,从而达到重新启动代谢的目的。
这称为补充代谢物。
第三步:重建细胞膜细胞膜是细胞最外层的保护层,它是保护细胞内部结构和功能的关键。
在细胞复苏的过程中,重建细胞膜结构是必不可少的步骤。
这个过程中,细胞需要重新组装复杂的膜结构,并将其纳入到细胞内部的各种复杂功能系统。
这包括从脂质、蛋白质等有机物质中提取所需成分,并使用细胞内特殊的机制重新组合,形成细胞膜磷脂双层结构,最终实现重新组装细胞膜的目的。
第四步:恢复细胞内外环境平衡细胞复苏的最后一步是重建细胞内外环境平衡。
在细胞复苏过程中,细胞内外环境的紊乱通常会被引起,这会影响到细胞的精细功能调控。
这个过程中,细胞需要重新建立环境平衡。
细胞通过水和离子通道来维持内、外环境的水和离子平衡状况。
同时,还需要恢复细胞内部固有的pH值和离子平衡等生物化学反应,这一步过程在细胞复苏过程中是非常关键的。
细胞复苏是一个重要的生物学过程,它涉及到多个步骤,其中包括细胞代谢的重新启动、细胞膜的重组,以及细胞内外环境的平衡调节等。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的:掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理:细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作,可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤:(一)材料准备:1. 仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-80℃)、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材:枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂:培养基、血清、双抗(青霉素、链霉素)。
4. 其他物品:记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
(二)细胞复苏步骤:1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管,于超净台中打开盖子,用枪头吸出细胞悬液,加到15ml离心管中(离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基),轻弹混匀。
3.离心,1 000 rpm,5 min。
4.弃去上清液,轻轻敲打重悬细胞,加入含10%FBS的细胞培养基,轻弹重悬细胞,调整细胞密度,接种培养皿,37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液,继续培养。
四、注意事项:1.拿出冻存的细胞后,尽快置于37℃水浴中融化,整个复苏过程要快;2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;3.细胞轻弹混匀,勿反复多次吹打。
一、目的:学习细胞传代培养的原理及一般方法,熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理:体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭,将培养的细胞分散,从容器中取出,以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养,即为传代培养。
细胞复苏的操作方法
细胞复苏的操作方法
细胞复苏是指将处于悬浮状态或冷冻保存状态的细胞,通过适当的处理方法,使其重新恢复到正常生长状态并继续进行繁殖和生长。
具体的操作方法如下:
1. 取出冷冻存储的细胞:将处于液氮存储罐内的细胞冷冻管快速放入预先准备好的70%乙醇中消毒,待消毒10秒后,取出放在无菌条件下的台面上。
2. 进行解冻处理:将细胞冷冻管立即放入预先准备好温水中,以室温解冻,每隔2-3分钟轻微摇晃管子,直到解冻完全,再立即将管子放到孵化箱内,避免冷冻时产生的压力冲击细胞,引起溶胞现象。
3. 处理细胞培养基:细胞培养基的PH值、温度、CO2浓度等条件需要顺应细胞情况逐渐恢复到正常生长状态,避免环境突变影响细胞的复苏和生长。
4. 加入细胞:将已解冻的细胞迅速转移到培养基中,先进行暴露5~10分钟,再进行转移至预处理好的细胞培养瓶中,尽可能使细胞均匀分散。
5. 稳定恢复期:转移后,避免环境的干扰干扰细胞的恢复稳定,维持细胞培养瓶内的清洁卫生环境,逐渐调节细胞培养的温度和CO2浓度,让其适应细胞定植状态,并逐渐达到正常的生长状态。
6. 定期观察:对于细胞进行定期观察,观察细胞的颜色、形态、大小等,以及
细胞繁殖情况、存活率等指标。
同时,还要注意细胞培养瓶内的清洁卫生环境,保证细胞的稳定生长和繁殖。
细胞复苏
细胞复苏
准备工作:
水浴锅打开并加热到39°C
70%酒精
将会使用到的试剂或耗材放入到生物安全柜并使用UV照射30min:
废液缸
Marker笔
酒精浸泡的棉花(用于实验后安全柜清洁)
15ml离心管
高压过1ml枪头
培养皿
完全培养基(根据ATCC配制)
生物安全柜消毒完成后,将屏障板打到一定高度,让气流回流10min.
复苏步骤:
1.将5ml完全培养基加入到15ml离心管中。
2.从-80°C冰箱中取冻存细胞系。
3.细胞迅速放入39°C水浴锅,不停地晃动,使细胞尽快融化(一般不超过1min)。
4.用70%酒精喷洒冻存管后转移到生物安全柜内。
5.用移液枪将融化细胞全部转移到含5ml细胞培养基的15ml离心管中。
6.吸取1ml完全培养基冲洗冻存管,将遗留在管壁上的细胞转移到15ml离心管中。
7.800rpm,常温(20°C),离心4min (0.04)。
注意配平。
8.离心期间将5ml完全培养基加入到底面积为25cm2培养瓶中。
9.离心后弃上清,加入1ml完全培养基重悬细胞,轻微吹吸以使细胞充分重悬。
10.将重悬细胞接种到培养瓶中。
11.“8”形轻轻摇晃培养瓶,使细胞更均匀地分布于培养瓶。
12.低倍镜下观察细胞是否均匀分布。
13.70%酒精消毒后放入培养箱中,培养条件为37°C,5% CO2。
细胞复苏,传代与冻存
一、目的:掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。
二、原理:细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作,可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、步骤:(一)材料准备:1. 仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-80℃)、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。
2. 耗材:枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。
3. 试剂:培养基、血清、双抗(青霉素、链霉素)。
4. 其他物品:记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。
(二)细胞复苏步骤:1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管,于超净台中打开盖子,用枪头吸出细胞悬液,加到15ml离心管中(离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基),轻弹混匀。
3.离心,1 000 rpm,5 min。
4.弃去上清液,轻轻敲打重悬细胞,加入含10%FBS的细胞培养基,轻弹重悬细胞,调整细胞密度,接种培养皿,37℃培养箱静置培养。
5.次日更换一次培养液,继续培养。
四、注意事项:1.拿出冻存的细胞后,尽快置于37℃水浴中融化,整个复苏过程要快;2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;3.细胞轻弹混匀,勿反复多次吹打。
一、目的:学习细胞传代培养的原理及一般方法,熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。
二、原理:体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭,将培养的细胞分散,从容器中取出,以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养,即为传代培养。
细胞复苏的注意事项
细胞复苏的注意事项细胞复苏是一项复杂的医学技术,常用于较长时间的心脏停跳或临床死亡后的心肺复苏。
在进行细胞复苏时,有几个重要的注意事项需要牢记。
首先,进行细胞复苏需要专业的医务人员。
细胞复苏是一个复杂的过程,需要有经验丰富的医生和护士进行及时的诊断和决策。
这些专业人员应该熟悉最新的细胞复苏准则,并具备应急处理的能力。
其次,及时的CPR(心肺复苏)是至关重要的。
CPR是细胞复苏的第一步,对于恢复细胞功能非常重要。
CPR应该在尽快的时间内开始,以提供充足的氧气和血液循环。
随着时间的推移,缺氧和血流紊乱会导致细胞死亡,就很难再恢复细胞功能了。
第三,维持心脏活动是关键。
如果心脏停跳时间超过几分钟,需要立即进行除颤和起搏来恢复心脏的正常节律。
除颤可以消除异常的心律,而起搏可以刺激心脏收缩,维持血液的循环。
第四,细胞复苏需要注意恢复呼吸功能。
在进行细胞复苏时,除了心脏功能,还需要关注呼吸功能。
如果病人无法自主呼吸,应该立即进行人工通气。
这可以通过呼吸囊或呼吸机来实现,以提供充足的氧气。
第五,细胞复苏也需要密切监测生命体征。
细胞复苏过程中,需要对病人的生命体征进行密切监测,包括心率、呼吸、血压和体温等。
这可以帮助医务人员评估复苏效果,及时调整治疗方案。
最后,进行细胞复苏还需要考虑病人的病因和基础疾病。
不同病因和基础疾病可能需要不同的处理方法。
因此,在进行细胞复苏时,医务人员需要了解病人的病史和诊断结果,并制定相应的治疗方案。
总之,细胞复苏是一项复杂而重要的医疗技术,需要专业人员的指导和实施。
遵循以上注意事项,可以提高细胞复苏的成功率,最大限度地恢复细胞功能,拯救生命。
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细胞复苏步骤注意事项:
【材料】
1. 常规细胞培养仪器设备恒温水浴振荡器。
2. 培养液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亚砜(DMSO)
【操作程序】
1. 细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
2. 培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱370C预热20min,备用。
3. 二甲基亚砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,备用。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400C水浴中,快速摇晃,直至冻存液完全融化。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。
6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。
7. 记录复苏日期。
【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。
此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2. 冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作较大,因此,必须在1-2min 内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题:目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。
因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大,死亡。
此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液体前倒净,且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。
5. 细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题:试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。
所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。
二、操作步骤
(一)冻存
1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。
5、将冻存管口封严。
如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。
冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。
注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。
液氮定期检查,随时补充,绝对不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
(二)复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟,弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。
三、试剂和器材
器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等
试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)
附:冻存液配制:
培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。
保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。
配好后4℃下保存。