表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

(H5N1)]由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开 放实验室保存；真核表达质粒 pCAGGS 由维斯康新 （麦迪逊）大学兽医学院病理生理系的 Yoshihiro Kawaoka 教授惠赠；含有 GD/1/96(H5N1) HA 基因的 DNA 疫苗质粒 pCIHA5 由陈化兰研究员构建。 1.2.2 SPF 鸡胚和 SPF 鸡 由哈尔滨兽医研究所实 验动物中心提供，3 周龄 SPF 鸡实验期间饲养于禽病 感染实验室的负压隔离器中。 1.2.3 HI 阳性抗原和二抗 针对 H5 亚型 AIV 的 HI 抗原由哈尔滨兽医研究所动物流感重点开放实验室保 存，荧光标记的二抗兔抗鸡 IgG（FITC IgG）及辣根 过氧化物酶标记的二抗兔抗鸡 IgG 购自 Sigma 公司。 1.3 试验方法 1.3.1 表 达 质 粒 pCAGGHA5 的 构 建 从 质 粒 pCIHA5 上用 XhoI 酶切并补平、SmaI 酶切后，将 HA 基 因 片 段 插 入 到 用 ClaI/SmaI 酶 切 处 理 的 载 体 pCAGGS 中。 1.3.2 H5 亚型 DNA 疫苗质粒在 293T 细胞中的体外 瞬时表达 将质粒 pCIHA5 和 pCAGGHA5 转染 293T 细胞，质粒转染 293T 细胞后 24 h、48 h 时，进行间 接免疫荧光检测，同时设未转染质粒的 293T 细胞阴 性对照及转染质粒后用阴性血清作用的阴性对照；质 粒转染 293T 细胞后 48 h 时进行 Western blot 分析。 1.3.3 DNA 疫苗质粒的大量制备及其纯化 在 JM 109 中扩增 DNA 疫苗质粒，碱裂解法提取，聚乙二醇 纯化质粒 DNA，紫外分光光度计定量后溶于磷酸盐缓 冲液(PBS)（pH 7.2）中冻存备用。 1.3.4 SPF 鸡的免疫保护试验 将 3 周龄 SPF 鸡随 机分为 5 组，4 或 5 只/组，腿部肌肉注射免疫。第 1 组用质粒 pCIHA5 100µg 免疫；第 2 组为 pCIHA5 10µg 免疫组；第 3 组为 pCAGGHA5 100µg 免疫组；第 4 组为 pCAGGHA5 10µg 免疫组；第 5 组为对照组，注 射 200 µl PBS 溶液。免疫后 4 周分别用 100LD50 的 GD/1/96(H5N1) HPAIV 经鼻腔途径感染，0.1ml/只， 攻毒后 2 周内每天观察记录鸡只的发病和死亡情况。 每组鸡于免疫后和攻毒后每周采集其翅静脉血，分离 血清，采用 HI、AGP 方法测定其相应的抗体滴度。 在攻毒后第 3 天、第 5 天和第 7 天采集每组鸡的泄殖 腔和喉头拭子，将每个拭子适当 10 倍连续稀释，每个
(1 Animal Influenza Laboratory of the Ministry of Agriculture, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001; 2 National Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001; 3 National Animal Husce of the Ministry Agriculture, Beijing 100026)
摘要：【目的】将 A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的 HA 基因插入鸡β-actin 启动子高效真 核表达载体 pCAGGS，构建了 DNA 疫苗质粒 pCAGGHA5，以提高 H5 亚型禽流感 DNA 疫苗的表达水平和免疫保护效果。 【方法】将 pCAGGHA5 和表达 GD/1/96(H5N1)HA 基因的质粒 pCIHA5 通过间接免疫荧光法和 Western-blot 分析检测 转染 293T 细胞后瞬时表达的 HA 抗原蛋白，随之将 pCAGGHA5 及 pCIHA5 分别以 100 µg 和 10 µg 剂量一次免疫 3 周 龄 SPF 鸡，4 周后用 100 LD50 的 HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和 Western-blot 分析表明 2 种表达质粒均可正确表达 H5 亚型 HA 抗原蛋白，载体 pCAGGS 表达水平显著高于载体 pCI；免疫 SPF 鸡 后，100µg pCAGGHA5 可形成 5/5 的免疫保护，100µg pCIHA5 可形成 2/4 的免疫保护，10µg pCAGGHA5 可形成对免 疫鸡 5/5 的免疫保护，而 10µg pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5 诱导的 HI 抗体水平远远高于 pCIHA5。 【结论】鸡β-actin 启动子表达载体 pCAGGS 可显著提高 HA 基因体外表达水平和 H5 亚型禽流感 DNA 疫苗诱导的 保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。
Key words: Avian influenza; H5 subtype; Chickenβ-actin promoter; DNA vaccine; Protective efficacy
0 引言
【本研究的重要意义】近年来发现，H5 亚型高致 病力禽流感不再单单是危害禽类的一种烈性传染病， 而是一个新的人畜共患传染病[1~4]，其公共卫生学意义 之大使得 H5 亚型禽流感的防制研究工作迫在眉睫。 DNA 疫苗可同时诱导体液免疫及相应的细胞免疫反 应，在克服了灭活疫苗的和普通亚单位疫苗缺点的同 时，又避免了重组活载体疫苗免疫反应受母源抗体、 循环抗体及细胞免疫记忆干扰的不足及其潜在的突变 危险，另外，DNA 免疫还有一个最突出的优点是可在 免疫后迅速启动有效而全面的免疫反应记忆效应[5, 6]， 是最具潜力的基因工程疫苗之一。【前人研究进展】真 核表达质粒是 DNA 疫苗的主体，表达载体表达抗原 蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答越强[3]。 因此，选择高效的表达载体是 DNA 疫苗的优化策略 之一。pCAGGS 为含有鸡的 β-actin 启动子和 CMV 增 强子的真核表达质粒，许多研究[7~12]证明 pCAGGS 具 有很高的表达效率，目前世界范围内许多研究者都利 用 它 来 进 行 相 关 研 究 。【 本 研 究 切 入 点 】 笔 者 以
A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)] HA 基因为免疫原基因及 CMV 启动子-增强子构建的 H5 亚型 DNA 疫苗 pCIHA5 高剂量免疫具有良好的免疫 保护性和长达一年的 HI 抗体持续期[13,14]，但仍存在免 疫剂量大、使用成本高、难以推广应用的严重缺陷。 【拟解决的关键问题】为了进一步提高 H5 亚型禽流 感 DNA 疫苗的免疫保护效果，将 GD/1/96(H5N1) HA 基因插入表达载体 pCAGGS 中构建了 H5 亚型 DNA 疫苗质粒 pCAGGHA5，并与质粒 pCIHA5 一起进行了 体外瞬时表达及 SPF 鸡免疫保护效果的比较研究。
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中国农业科学
39 卷
the chickens in the pCIHA5 immunized group and the control group died within ten days. 【Conclusion】 Results shown that expressive vector optimization enhanced the protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine.
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点 本试验于 2004 年在哈尔滨兽医研究所农业部动
物流感重点开放实验室进行，动物试验于 2004 年在哈 尔滨兽医研究所禽病感染实验室进行。 1.2 试验材料 1.2.1 病毒和质粒 攻毒用高致病力禽流感病毒 （HPAIV）A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1) [GD/1/96
Abstract: 【Objective】 To improve the protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine, the HA gene of A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)] was inserted into pCAGGS, which contains chickenβ-actin promoter, and was designated as pCAGGHA5. 【Method】The monolayer 293T cells were transfected by pCAGGHA5 and pCIHA5, which contained HA gene of GD/1/96(H5N1). The HA protein expression was detected by indirect immunofluorescence assay 24-48 h after transfection and confirmed by western blotting analysis. To evaluate the vaccine efficacy, groups of 3-week-old SPF chickens were intramuscular inoculated with 100 μg or 10 μg of pCIHA5, pCAGGHA5, respectively. A group of chickens were injected with 200 μl PBS as control. Four-weeks after the single vaccination, all chickens were challenged with 100 LD50 of highly pathogenic GD/1/96(H5N1). 【Results】 In vitro expression results indicated the gene in the pCAGGS vector was better expressed than that in the pCI vector. The chickens in the 100μg and 10μg pCAGGHA5 immunized groups were completely protected from virus challenge (no disease signs, no virus shedding and no deaths), and 100μg pCIHA5 immunized groups only provided partial protection, while