1抗原抗体反应实验06jing
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液相沉淀：以无机盐缓冲液为介质。 琼脂扩散：以凝胶为介质。
- radial immunodiffusion （单相扩散） - double immunodiffusion （双相扩散） 凝胶免疫电泳：在直流电场中进行的凝胶扩散。 - rocket immunoelectrophoresis （火箭电泳）
* 实验流程
抗体+琼脂琼脂板
打孔数个(孔与板缘距离1cm)
加入样品(由低浓度到高浓度) 电泳
2020/6/8
倍比稀释：
50ul 血清
50ul 50ul
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
50ul 稀释液
2020/6/8
倍比稀释
•1－5管分别加入50l 稀释液 •加入50l 原液于第1管，这样第1管被稀释为1：2 • 从1管吸出50l ，加入2管，2管的浓度为1管的一半（1：2）
X-Ray crystallography studies of antigens and antibodies interacting shows that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the combining site of the antibody as illustrated in Figure. Thus, our concept of Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab).
2020/6/8
4 types of noncovalent forces
2020/6/8
三. 特点
• 特异性和交叉反应 • 可逆性
一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等） →抗原-抗体可被解离
• 最适比例 反应体系中抗原/抗体最适比例 →决定反应结果的关键因素
2020/6/8
2020/6/8
四. 影响因素
• 抗原-抗体结合力
疏水作用,氢键,范德华引力,静电 吸引作用
2020/6/8
The concept of Ag-Ab interaction
The combining site of an antibody is located in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains.
2020/6/8
免疫沉淀反应(precipitation)
原理 可溶性抗原+抗体白色沉淀
内容 单向定量免疫电泳(火箭电泳) 琼脂糖双向免疫扩散
2020/6/8
单向定量免疫电泳(火箭电泳)
• 把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀弧形似火箭。 • 当定量的抗原在含有适量抗体的琼脂中泳动时，走在前面的
• 将抗体混入琼脂内; • 将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，
进行电泳; • 抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形
沉淀峰（形如火箭）, 峰高与抗原含量成正比; • 以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘
制标准曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待 测样品中的抗原含量。
2020/6/8
No.
C
2020/6/8
1
2
3
4
1:1
1:2
1:4
1:8 1:16
打孔
• 将胶版置于模板上，用打孔器在琼脂板的一端 垂直，间隔均匀地打一排小孔，用针头小心， 完整地挑出孔中琼脂
agarose slide
2020/6/8
2020/6/8
沉淀反应特点:
液相沉淀：
• Ag、Ab自由接触，需时短。
琼脂扩散：
• Ag、Ab在固相化的凝胶中扩散，比液相慢，但Ag／Ab 复合物不易散开，位置稳定，适合染色分析，可长期保存 结果。
凝胶免疫电泳：
• 在电场下扩散和反应速度加快，节省时间。
• 电场规定了扩散方向，使反应集中，灵敏度提高。
(一) 反应物自身因素 1. 抗体 * 来源: 不同动物免疫血清具反应差异。 * 特异性与亲和力：难以两全其美。 * 浓度：必须滴定抗体。 2. 抗原 * 理化性质、表位多寡和种类
2020/6/8
(二) 环境条件 1. 电解质 不可缺少 2. 酸碱度 pH 6-8 3. 温度 15-40c 4. 时间 规定时间
2020/6/8
本次实验涉及的抗原抗体反应 1. 沉淀反应（Precipitation）--- 可溶性抗原与 相应抗体在适当条件下发生结合而出现的沉淀 现象。
2. 凝集反应（Agglutination）--- 颗粒性抗原 与相应抗体结合后所呈现的肉眼可见的凝集现 象。
2020/6/8
沉淀反应分类:
2020/6/8
抗原抗体反应
• 概念 • 基本原理 • 特点 • 影响因素 • 应用范围
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ20/6/8
一、概念
• 抗原和抗体的特异性结合反应 体内 产生保护效应
造成病理损伤
体外 多种表现形式:凝集,沉淀,补体结合,中和等.
2020/6/8
二. 基本原理
• 抗原和抗体分子结构 及立体构型的互补
2020/6/8
五. 应用范围
• 用已知抗原检测未知抗体 • 用已知抗体检测未知抗原 • 大分子物质 • 药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质
2020/6/8
抗原抗体反应的基本类型 1. Precipitation--2. Agglutination--3. Radioimmunoassay 4. Enzyme-linked Immunosorbent Assay 5. Immunofluorescence 6. Western Blotting 7. Flow Cytometry and Fluorescence 8. Immunoelectron Microscopy
抗原遇到琼脂中的抗体时，达到适当比例时形成大的不溶性 复合物而发生沉淀，不再移动； • 未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀 继续向前迁移，形成新的沉淀，但沉淀带越来越窄，直至全 部抗原与抗体结合形成火箭峰样沉淀。 • 抗原含量越高，火箭峰越长。
2020/6/8
单向定量免疫电泳(火箭电泳)
- radial immunodiffusion （单相扩散） - double immunodiffusion （双相扩散） 凝胶免疫电泳：在直流电场中进行的凝胶扩散。 - rocket immunoelectrophoresis （火箭电泳）
* 实验流程
抗体+琼脂琼脂板
打孔数个(孔与板缘距离1cm)
加入样品(由低浓度到高浓度) 电泳
2020/6/8
倍比稀释：
50ul 血清
50ul 50ul
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
50ul 稀释液
2020/6/8
倍比稀释
•1－5管分别加入50l 稀释液 •加入50l 原液于第1管，这样第1管被稀释为1：2 • 从1管吸出50l ，加入2管，2管的浓度为1管的一半（1：2）
X-Ray crystallography studies of antigens and antibodies interacting shows that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the combining site of the antibody as illustrated in Figure. Thus, our concept of Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab).
2020/6/8
4 types of noncovalent forces
2020/6/8
三. 特点
• 特异性和交叉反应 • 可逆性
一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等） →抗原-抗体可被解离
• 最适比例 反应体系中抗原/抗体最适比例 →决定反应结果的关键因素
2020/6/8
2020/6/8
四. 影响因素
• 抗原-抗体结合力
疏水作用,氢键,范德华引力,静电 吸引作用
2020/6/8
The concept of Ag-Ab interaction
The combining site of an antibody is located in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains.
2020/6/8
免疫沉淀反应(precipitation)
原理 可溶性抗原+抗体白色沉淀
内容 单向定量免疫电泳(火箭电泳) 琼脂糖双向免疫扩散
2020/6/8
单向定量免疫电泳(火箭电泳)
• 把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀弧形似火箭。 • 当定量的抗原在含有适量抗体的琼脂中泳动时，走在前面的
• 将抗体混入琼脂内; • 将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，
进行电泳; • 抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形
沉淀峰（形如火箭）, 峰高与抗原含量成正比; • 以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘
制标准曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待 测样品中的抗原含量。
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No.
C
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1
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1:1
1:2
1:4
1:8 1:16
打孔
• 将胶版置于模板上，用打孔器在琼脂板的一端 垂直，间隔均匀地打一排小孔，用针头小心， 完整地挑出孔中琼脂
agarose slide
2020/6/8
2020/6/8
沉淀反应特点:
液相沉淀：
• Ag、Ab自由接触，需时短。
琼脂扩散：
• Ag、Ab在固相化的凝胶中扩散，比液相慢，但Ag／Ab 复合物不易散开，位置稳定，适合染色分析，可长期保存 结果。
凝胶免疫电泳：
• 在电场下扩散和反应速度加快，节省时间。
• 电场规定了扩散方向，使反应集中，灵敏度提高。
(一) 反应物自身因素 1. 抗体 * 来源: 不同动物免疫血清具反应差异。 * 特异性与亲和力：难以两全其美。 * 浓度：必须滴定抗体。 2. 抗原 * 理化性质、表位多寡和种类
2020/6/8
(二) 环境条件 1. 电解质 不可缺少 2. 酸碱度 pH 6-8 3. 温度 15-40c 4. 时间 规定时间
2020/6/8
本次实验涉及的抗原抗体反应 1. 沉淀反应（Precipitation）--- 可溶性抗原与 相应抗体在适当条件下发生结合而出现的沉淀 现象。
2. 凝集反应（Agglutination）--- 颗粒性抗原 与相应抗体结合后所呈现的肉眼可见的凝集现 象。
2020/6/8
沉淀反应分类:
2020/6/8
抗原抗体反应
• 概念 • 基本原理 • 特点 • 影响因素 • 应用范围
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ20/6/8
一、概念
• 抗原和抗体的特异性结合反应 体内 产生保护效应
造成病理损伤
体外 多种表现形式:凝集,沉淀,补体结合,中和等.
2020/6/8
二. 基本原理
• 抗原和抗体分子结构 及立体构型的互补
2020/6/8
五. 应用范围
• 用已知抗原检测未知抗体 • 用已知抗体检测未知抗原 • 大分子物质 • 药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质
2020/6/8
抗原抗体反应的基本类型 1. Precipitation--2. Agglutination--3. Radioimmunoassay 4. Enzyme-linked Immunosorbent Assay 5. Immunofluorescence 6. Western Blotting 7. Flow Cytometry and Fluorescence 8. Immunoelectron Microscopy
抗原遇到琼脂中的抗体时，达到适当比例时形成大的不溶性 复合物而发生沉淀，不再移动； • 未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀 继续向前迁移，形成新的沉淀，但沉淀带越来越窄，直至全 部抗原与抗体结合形成火箭峰样沉淀。 • 抗原含量越高，火箭峰越长。
2020/6/8
单向定量免疫电泳(火箭电泳)