碱性磷酸酶-基因实验
常见的报告基因
常见的报告基因基因是生命的基本单位，它负责传递遗传信息并决定我们的遗传特征。
在基因研究中，科学家经常使用报告基因来研究基因在细胞中的表达和调控。
报告基因是一种易于检测和测量的基因，它可以通过特定的实验技术来标记和定量分析。
本文将介绍一些常见的报告基因及其在生物研究中的应用。
1. 绿色荧光蛋白（GFP）GFP是最著名和最常用的报告基因之一。
它是从水母中发现的一种蛋白质，具有绿色荧光特性。
通过将GFP基因与感兴趣的基因融合，科学家可以实时观察这些基因在细胞或生物体中的表达情况。
GFP的应用十分广泛。
在细胞生物学研究中，科学家可以利用GFP来标记和跟踪细胞的位置、形态变化和运动方式。
在生物医学研究中，GFP可用于追踪病菌在宿主中的定位和扩散情况。
此外，GFP还可以用于标记和追踪蛋白质在细胞中的定位和交互方式。
因其广泛应用和可靠性，GFP已成为许多研究领域的重要工具。
2. 荧光素酶（Luciferase）荧光素酶是一类产生荧光的酶，可以与荧光素底物反应产生可见光。
Luciferase基因被广泛用作报告基因，因其检测灵敏度高、快速和可定量的特点。
Luciferase的应用广泛用于研究基因转录、蛋白质互作和细胞信号传导等生物学过程。
通过将Luciferase基因与感兴趣的基因进行融合，科学家可以测量目标基因在细胞中的表达水平和动态变化。
此外，Luciferase还可以用于检测细胞凋亡、药物筛选和生物传感器等方面的研究。
3. β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-半乳糖苷酶是一种常见的酶，它能够催化底物X-Gal的降解产生蓝色产物。
β-Gal基因常被用作报告基因来研究基因的表达和调控。
β-Gal的应用广泛用于研究基因在细胞和生物体中的表达模式。
通过将β-Gal基因与目标基因进行融合，科学家可以观察其在细胞中的表达情况。
此外，β-Gal也可用于检测基因转导效率、病毒感染和细胞分化等方面的研究。
4. 碱性磷酸酶（AP）碱性磷酸酶是一种在生物体中广泛存在的酶，它可以催化底物产生阳性的紫色沉淀物。
碱性磷酸酶-基因实验
内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的
构建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：
指导教师：
二〇一三年八月十二日
二、实验方案
1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：
实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG 诱导、SDS-PAGE鉴定等。
关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化；
超声破碎的方案优化。
2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：依据技术路线完成试验。
实验方法：实验室常用技术。
技术路线：
实验方案：详细方案已于讲义给出。
可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，
实验的可行性很高。
注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。
碱性磷酸酶(AKP)
AP的生理及研究作用
①可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分
泌及骨化过程中发挥了重要作用 ②在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性内切 酶切割后的载体DNA，去除载体DNA两末端的5′-磷 酸残基，以防止载体DNA自我环化，从而提高其重
组效率 。
谢谢
金属离子的作用
②酶与底物以金 属离子Zn为桥接 点，金属将底物 磷酸引导到正确 的位置（Ser-活 性部位），使酶 促反应顺利进行。
金属离子的作用
③金属Zn1中和
离去基团的负电
荷，是RO―能
够顺利离去。
金属离子的作用
④Mg定位了水
分子，催化Ser-
102的质子化和
去质子化的反应。
金属离子的作用
Zn1原子配位的氢氧根离 子进攻磷酸基，形成POH键，最终形成无机磷 酸盐与底物的非共价结 合形式。
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系
中国水产科学 2011年1月, 18(1): 208–213 Journal of Fishery Sciences of China研究简报收稿日期: 2010−01−28; 修订日期: 2010−03−15.基金项目: 国家自然科学基金项目(30271017); 国家教育部博士项目基金(20040264001). 作者简介: 田娟(1984–), 硕士, 研究方向为鱼类发育生物学. E-mail: tian_hjuan@ 通讯作者: 施志仪(1954–), 教授. Tel: 021-********; E-mail: zyshi@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.00208碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系田娟, 施志仪上海海洋大学 生物技术研究中心,上海 201306摘要: 为了探讨碱性磷酸酶(ALP)基因在大菱鲆(Scophthatmus maximus )体内的表达情况及在细胞水平上三碘甲状腺原氨酸(T3)对碱性磷酸酶(ALP)基因表达量的影响, 利用荧光定量PCR 法检测了大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织中ALP mRNA 的表达情况, 并且用0 nmol/L 、50 nmol/L 、75 nmol/L 、100 nmol/L 、200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC), 采用实时荧光定量PCR 法测定T3处理后细胞中ALP mRNA 的表达情况。
结果表明, ALP mRNA 在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同, 具有组织特异性。
心脏组织中ALP mRNA 的表达量最高, 其次是肝脏组织中和鳃组织中, 肌肉组织中ALP mRNA 的表达量最少。
不同浓度T3处理后大菱鲆肾细胞后, 细胞中碱性磷酸酶基因的表达量存在明显的差异, ALP mRNA 的表达量随着T3浓度的增加有递增趋势。
结论认为, ALP 基因在大菱鲆成鱼8个不同组织中均有表达, 但其表达量却有明显的差异, 具有组织特异性。
血清碱性磷酸酶活性测定
检测方法的准确性评估
参考方法：国际标 准或国家标准的血 清碱性磷酸酶活性 测定方法
准确性评估指标： 回收率、精密度、 线性范围、干扰因 素等
准确性评估方法： 与参考方法进行比 对，或与其他实验 室进行比对
操作规程标准化：制定标准化的操作规程，确保检测过程的规范性和一致性。
室内质量控制：通过定期进行室内质量控制，监控检测过程的稳定性和准确性，及时发现 并纠正误差。
实验室间质量控制
定期进行实验室间比对实验，确 保不同实验室间的检测结果具有 可比性。
对实验室内部质量控制数据进行 分析，及时发现和解决潜在问题。
检测方法的标准化
检测方法的标准化是确保血清碱性磷酸酶活性测定准确性和可靠性的关键步骤。
标准化包括使用统一的仪器设备、试剂和操作程序，以及定期对标准品进行校准等。
标准化可 标准化对于血清碱性磷酸酶活性测定的临床应用和科学研究具有重要意义。
检测方法的临床应用范围
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参与权威机构组织的质控活动， 获取质控样品并按照要求进行检 测。
关注国内外质量控制动态，更新 质量控制方法和标准。
质量控制的监测指标
精密度：测定结果的重复性和稳 定性
灵敏度：检测低浓度样本的能力
添加标题
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准确度：测定结果与真实值的接 近程度
抗干扰能力：抵抗非特异性物质 干扰的能力
药物使用：某些药物可能影响血 清碱性磷酸酶活性。
药物因素
药物种类：不 同药物对血清 碱性磷酸酶活 性的影响不同
大肠杆菌碱性磷酸酶分子改造 高效表达研究及应用
一、碱性磷酸酶的特性
3、底物特异性：碱性磷酸酶具有多种底物特异性，可根据底物的不同分为不 同的亚型。例如，肠型碱性磷酸酶（intestinal alkaline phosphatase，IAP） 主要催化小分子磷酸酯的水解，而骨型碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BAP）则主要催化磷酸基团从骨胶原等大分子中释放。
背景
背景
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种丝氨酸磷酸酶，能够催化磷酸基团的裂解，具有 广泛的底物特异性。然而，天然的大肠杆菌碱性磷酸酶在某些应用场景下可能存 在一定的局限性，例如催化效率不高、稳定性欠佳等。因此，针对大肠杆菌碱性 磷酸酶的分子改造和高效表达研究具有重要的实际意义。
目的
目的
本次演示的研究目的是通过对大肠杆菌碱性磷酸酶进行分子改造，提高其催 化效率和稳定性，并探究高效表达的策略。具体研究问题包括：1）如何对大肠 杆菌碱性磷酸酶进行分子改造？2）这些改造对酶的催化效率和稳定性有何影响？ 3）如何实现大肠杆菌碱性磷酸酶的高效表达？
二、碱性磷酸酶的应用
二、碱性磷酸酶的应用
1、生物分析：由于碱性磷酸酶具有优良的底物特异性，因此在生物分析领域 有着广泛的应用。例如，可以利用AP的底物特异性来检测特定分子或信号通路的 活性，从而为研究生物过程提供有用的信息。
二、碱性磷酸酶的应用
2、生物工程：在生物工程领域，碱性磷酸酶被广泛应用于基因工程和蛋白质 工程中。例如，可以利用AP的活性位点来设计新型的催化剂和药物分子。此外， AP还可以作为基因治疗和疫苗佐剂中的关键成分，用于调节免疫反应。
内容摘要
对于昆虫碱性磷酸酶的研究，主要集中在不同种类昆虫中碱性磷酸酶的分类、 基因结构、表达调控等方面。根据目前的研究成果，昆虫碱性磷酸酶可以分为多 个亚家族，每个亚家族具有不同的基因结构和表达调控特征。例如，在蝗虫中发 现了两种碱性磷酸酶，分别命名为APL1和APL2，它们在基因结构上存在明显的差 异，同时在表达调控上也表现出不同的特征。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于 合成磷酸酯、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质剪切
碱性磷酸酶可以催化蛋白质剪切，对蛋白质的结构和 功能进行修饰。
生产药物
碱性磷酸酶可以用于制备药物，如抗癌药物、抗生素 等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可 以反映肝细胞的损伤程度。
碱性磷酸酶可以作为营养补充剂，用于补充 人体所需的矿物质和维生素。
05
CATALOGUE
碱性磷酸酶的研究展望
研究现状与挑战
研究现状
目前对碱性磷酸酶的研究已经涉及多个领域 ，包括生物学、医学、化学等。在生物体内 ，碱性磷酸酶的作用是参与磷酸基转移反应 ，具有重要的作用。然而，对于碱性磷酸酶 的精确调控机制，仍需进一步研究。
琼脂糖凝胶电泳
利用琼脂糖凝胶作为支持物，根据蛋 白质分子大小和形状的不同进行分离 。
03
CATALOGUE
碱性磷酸酶的酶学性质
酶的磷酸酶的米氏方程可以表示为V=Vmax\*[S]/（ Km+[S]），其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率， [S]是底物浓度，Km是米氏常数。
挑战
尽管已经对碱性磷酸酶进行了广泛的研究， 但仍存在许多挑战。例如，如何提高碱性磷 酸酶的分离纯化效率，以及如何精确调控碱 性磷酸酶的酶学性质等。此外，对于碱性磷 酸酶在生物体内的具体作用机制，也需要进
一步深入研究。
未来研究方向
研究方向1
进一步探究碱性磷酸酶的调控机制。 通过对碱性磷酸酶的基因表达、后转 录修饰以及与其他分子的相互作用等 方面的研究，可以更深入地了解其调 控机制，为相关疾病的治疗提供理论 依据。
小鼠alp的pcr序列
小鼠alp的pcr序列PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术，在分子生物学研究中有广泛应用。
在这个任务中，我将介绍小鼠碱性磷酸酶（ALP）的PCR序列。
小鼠ALP是一种重要的酶，在细胞内起着关键的生物学功能。
为了研究ALP基因的表达或变异，我们可以使用PCR技术扩增与ALP基因相关的DNA片段。
首先，确定我们感兴趣的PCR目标片段是小鼠ALP的一部分。
我们需要根据ALP的基因序列设计一对引物，这对引物应该能特异性地结合于ALP的目标区域，并产生一个合适长度的PCR产物。
对于小鼠ALP，我们可以选择以下引物序列：引物1：5'-AGTCAGCTGAAGTCTGGGAG-3'引物2：5'-CTGCTTCCGAGACAGAGAGG-3'这对引物的序列是根据小鼠ALP基因的编码序列设计的，并且在目标区域上具有高度特异性。
接下来，我们可以使用PCR反应体系来扩增小鼠ALP的DNA片段。
一个典型的PCR反应体系包含以下组分：1. 模板DNA：从小鼠细胞提取的基因组DNA作为PCR的模板。
2. 引物：ALP特异性的引物1和引物2。
3. dNTPs：包含各种四个核苷酸的混合物。
4. 缓冲液：提供理想的pH条件和离子强度。
5. 酶：通常使用热稳定DNA聚合酶（如Taq聚合酶）。
6. 去离子水：作为反应体系的溶剂。
根据PCR仪器的建议和优化实验条件，我们可以进行PCR反应。
典型的PCR温度梯度如下：1. 反应前的预热：95°C，5分钟。
2. PCR循环：a. 95°C，30秒（变性，使模板DNA解链）。
b. 引物结合温度，例如60°C，30秒（引物与模板DNA结合）。
c. 延伸温度：72°C，30秒-1分钟（酶的最佳活性温度）。
3. 延伸结束后，进行最终延伸：72°C，5分钟（确保所有PCR产物完全延伸）。
4. 最后，将反应体系储存于4°C，或进行后续实验。
基因工程考试题目整理
1.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。
Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。
（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。
筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。
（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。
（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。
通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。
以X-gal作为指示剂。
若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。
（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。
（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程1.检验原理：(对硝基酚磷酸盐连续监测法)以磷酸对硝基酚二钠(PNPP)为底物，2—氨基-2-甲基丙醇(AMP)为磷酸酰基的受体。
在碱性环境，碱性磷酸酶催化PNPP水解产生的游离对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。
根据在405nm 处吸光度增高速率来计算碱性磷酸酶的活性单位。
PNPP+H2O9阻'->对硝基酚+无机磷-20°C保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法；仪器法(详见DF-603/DI-600标准操作规程)5.参考范围6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%(W∕V)的氯化钠溶液稀释样本。
7.2.单位换算：ukat∕L=U∕L*16.67*IO-38.检验方法的局限性8.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在405nm处吸光度大于1.000时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：R1：无色透明液体，无悬浮物及沉淀；R2无色或淡黄色透明液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在37℃、405rπn处，光径IenI时，空白吸光度A≤1.0008.4空白吸光度变化率：在37C、405nm处，光径ICm时，用生理盐水作为样品加入试剂测试时，Z∖A∕minW0.005.1.15分析灵敏度：在405nm处,光径Icm时，测量120U/L的碱性磷酸酶时，吸光度变化4A∕min20.015.8.6线性范围：试剂的线性区间为[25-750]U∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[25-100]U/L区间内，线性绝对偏差不超过土10U/L；(100-750)U/L区间内,线性相对偏差不超过±10%。
8.7重复性:CV≤5%8.8批间精密度:R≤10%8.9准确度：相对偏差应不大于±10%。
8.10稳定性：(2-8)C下，原包装存放的试剂有效期为12个月,取到期后一个月的试剂进行测试，应满足1-7、9的要求。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
碱性磷酸酶(AKP)的特性分析研究
碱性磷酸酶（AKP）的特性分析研究摘要：碱性磷酸酶（akp）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。
本实验由含pet21a-akp表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。
本实验通过对纯化之后的akp进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对akp活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定akp的最适温度和ph以及akp的变性和复性等实验来研究akp的特性。
关键词：碱性磷酸酶（akp）；反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ ec. 3. 1. 3. 1），是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 kda。
它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。
大肠杆菌碱性磷酸酶被phoa 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。
碱性磷酸酶即akp来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。
akp广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。
akp能催化除去dna、rna、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状dna两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒dna的自身环化；蛋白质的去磷酸化。
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将akp 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。
akp作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。
本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。
酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适ph、温度25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
分子生物实验报告
碱性磷酸酶AKP的克隆与筛选摘要：利用PCR技术扩增碱性磷酸酶基因；在含有Carb和Tet的LB液体培养基上接种含pETBlue-2质粒的Novablue宿主菌，过夜培养；采用质粒试剂盒提取两管pETblue-2质粒；按照质粒2ul每样品孔、PCR产物50ul每样品孔打样于琼脂糖凝胶，利用琼脂糖凝胶电泳，检测质粒质量，将PCR产物切胶回收。
配制酶切体系，进行目的基因与载体的双酶切。
电泳检测酶切产物，并切胶回收。
制备感受态细胞（所选择的细胞为DH5α），配制连接反应体系，连接目的基因和载体的酶切产物。
转化感受态细胞，过夜培养，筛选出重组菌，提取转化重组菌质粒，酶切质粒，对酶切情况进行电泳鉴定。
引言：聚合酶链反应，即PCR技术是美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种快速扩增特定DNA序列的方法。
通过使双链DNA 分子热变性，两条引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，以单链DNA为模板引物延伸。
进行碱性磷酸酶的克隆与筛选，首先要扩增AKP基因；选取合适的载体，本实验选取质粒pETblue-2作为载体。
选取DH5α作为受体菌，DH5α是带Lacz ΔM15基因型的受体细菌，lacZ的M15是表达β－半乳糖苷酶α片端的一段基因，当M15缺失（△M15）时lacZ基因只能表达ω片端，β－半乳糖苷酶没有活性。
当载体上的LacZ基因完整时，由α-互补而产生的半乳糖苷酶在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，反之若因目的基因插入使得载体上的LacZ基因不完整时，产生没有活性的半乳糖苷酶，菌落呈白色。
1.材料与方法1.1大肠杆菌K12碱性磷酸酶的克隆1.1.1实验原理PCR技术是通过分离目的片段，再进行DNA扩增与定量，可用于医学用途和传染病诊治。
PCR技术需要的原料有模板dNTP、Taq酶、10xbuffer、Mg2+：0.5-5mM 和引物，经历高温变性、中温退火、低温延伸三个过程。
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定
米氏常数Km：描述酶与 底物亲和力的常数
底物浓度与反应速率的关 系：底物浓度越高反应速 率越快
酶浓度与反应速率的关系： 酶浓度越高反应速率越快
温度与反应速率的关系： 温度越高反应速率越快
pH值与反应速率的关系： pH值影响酶的活性从而 影响反应速率
Km值的含义与计算方法
Km值：酶促反应中酶的活性与底物浓度的比值表示酶与底物的亲和力 计算方法：通过酶促反应速率与底物浓度的关系曲线利用米氏方程计算得出 Km值的意义：反映酶与底物的亲和力是酶学研究中的重要参数 Km值的应用：在药物设计、酶工程等领域具有重要应用价值
• 实验目的：测定碱性磷酸酶的Km值
• 实验原理：通过酶促反应动力学原理测定酶的活性和底物浓度的关系
• 实验步骤： . 准备实验材料：酶、底物、缓冲液等 b. 设定反应条件：温度、pH值、反应时间等 c. 测定酶活性：通 过酶促反应速率测定酶活性 d. 测定底物浓度：通过酶促反应速率测定底物浓度 e. 计算Km值：通过酶促反应速率和 底物浓度的关系计算Km值
配制反应溶液：按照实 验要求配制反应溶液包 括酶促反应试剂、碱性
磷酸酶、缓冲液等
加入底物：在反应容器 中加入底物并记录底物
浓度
加入酶促反应试剂：在 反应容器中加入酶促反 应试剂并记录酶促反应
试剂浓度
反应开始：在反应容器 中加入碱性磷酸酶并记
录碱性磷酸酶浓度
反应结束：反应进行一 段时间后记录反应时间、
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实验结论与展望
实验结论总结
实验结果表明碱性 磷酸酶Km值与酶 促反应动力学密切 相关
实验数据表明碱性 磷酸酶Km值在不 同条件下的变化规 律
实验结果对于理解 酶促反应动力学具 有重要意义
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
碱性磷酸酶
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。
这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。
其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。
生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。
生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。
AKP被phoA 基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。
碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。
ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。
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内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的
构建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：
指导教师：
二〇一三年八月十二日
二、实验方案
1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：
实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG 诱导、SDS-PAGE鉴定等。
关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化；
超声破碎的方案优化。
2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：依据技术路线完成试验。
实验方法：实验室常用技术。
技术路线：
实验方案：详细方案已于讲义给出。
可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，
实验的可行性很高。
注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。