医学-实验五土壤中细菌纯种分离和培养

三、仪器和材料
样 品：新鲜土壤 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 无菌水：带有玻璃珠装有90mL无菌水三角
瓶、装有9mL无菌水的试管。 其 它：无菌培养皿(直径75毫米) 、无菌玻
璃移液管、酒精灯、培养箱等 。
四、操作步骤
（一）细菌纯种分离的操作方法
细菌纯种分离的方法有两种： 1、稀释平板法 2、平板划线法
注意无菌操作。 平板划线要注意染菌，同时注意划线深
度和密度。
六、思 考 题
1．分离土壤中的细菌时为什么要稀释？ 2．用一根无菌移液管接种几种浓度的水
样时，应从哪个浓度开始？为什么？ 3．如何检验平板上某个单菌落是不是纯
培养？
Thank you
（二）培养
将前面制作的平板倒置于培养箱， 30℃培养24～48h，然后观察结果。
（三）挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌 落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此 菌落采取稀释平板法或划线分离法分离， 直至获得纯培养。
分离平板
五、注意事项
制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀 分散在稀释液中。
注意：在土壤稀释过程中，吸取不 同梯度的菌液需换用不同的吸管。
（3）平板的制作 ①吸取菌液：
用无菌移液管吸取菌 液于无菌培养皿内。
注意：在无菌培养皿底部注明稀释度。 注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀。
②倒平板：
♫ 将 融 化 并 冷 至 约 50℃ 的牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入培养皿内。
实验五
土壤中细菌分离、纯化和培养
一、目的要求
1、初步掌握从土壤中分离和纯化细菌的 基本方法。
2、练习微生物接种和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现 有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同 土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细 菌数量最多。用挑单孢法、稀释涂布平板法 或平板划线法获得一种或一株微生物。
1、稀释平板分离法
（1）取样 选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm 深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌 的袋内，wenku.baidu.com好袋口，做好编号记录，携回实 验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
◆ 将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按 10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。
◆ 称取土样10g放入盛90mL无菌水并带有玻 璃珠的三角瓶中，用手摇10min，使土样均 匀分散，制成（10-1）土壤悬液。
◆ 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取lmL 10-1浓度的菌液于另一管9mL无菌水中，将移液 管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。
◆ 同样方法，依次稀释到10-6。
（2）划线
用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指 和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手 拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环 伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组 做三皿）。
注意：切勿划破培养基
划线的方式可取图中任何一种
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
♫将培养皿平放在桌上， 顺时针和反时针来回转 动培养皿，使培养基和 菌液充分混匀，冷凝后 即成平板（每组制培养 皿3套）。
③对 照 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待
凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。
2、平板划线分离法
（1）平板的制作
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平 板。