04 实验四 植物DNA的提取和鉴定(十六烷基三甲基溴化铵,CTAB)
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）
CTAB（⼗六烷基三甲基溴化铵）⼗六烷基三甲基溴化铵别称西曲溴铵、溴棕三甲基铵、溴烷铵，鲸熔三甲基溴化铵；CTAB；CTMAB；HTAB；CTABr；分类季铵盐分⼦式 C16H33(CH3)3NBr分⼦量 364.446熔点: 250-237℃⽔溶性 13 g/L (20°C)纯度(含量) ＞99%性质本品呈⽩⾊或浅黄⾊结晶体⾄粉末状，易溶于异丙醇，可溶于⽔,震荡时产⽣⼤量泡沫，能与阳离⼦、⾮离⼦、两性表⾯活性剂有良好的配伍性。
具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、⽣物降解性及杀菌等性能。
本品化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。
⽤途本品为天然、合成橡胶、硅油和沥青乳化剂；合成纤维、天然纤维和玻璃纤维的抗静电剂、柔软剂；护发素的调理剂；相转移催化剂；乳液起泡剂、表⾯活性剂，分析试剂，涤纶真丝化剂，⽪⾰加脂剂，它还⽤于助焊剂、焊锡膏⽣产⾥起表⾯活性剂作⽤，活性强，对亮点、虚焊、焊电饱满都有⼀定作⽤。
CTAB法提取DNA试剂：1）2×CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巯基⼄醇。
即称取CTAB 2 g加蒸馏⽔40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后⽤蒸馏⽔定容到100ml（提取前加⼊2%的巯基⼄醇，100ml加0.2ml巯基⼄醇）2）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris碱；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH⾄8.0，定容⾄100ml3）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml⽔中加⼊18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，⽤NaOH调PH⾄8.0（约2gNaOH颗粒），定容⾄100ml4）5M NaCl 100ml：称取29.22g NaCl ，⽤ddH2O定容到100ml5）3M NaAc 10ml：称取2.46g NaAc，⽤ddH2O定容到10ml操作步骤：1、称取1.0g幼嫩的叶⽚，在研钵中加⼊液氮预冷，将叶⽚放到液氮中研磨均匀，直⾄全部研磨⾄粉末，转⼊1.5ml离⼼管中，加⼊600 ul 65℃预热的CTAB溶液（⽤前加⼊2%的巯基⼄醇）2、将装有CTAB和样品的EP管放⼊65℃⽔浴，约1h3、冷却后，加⼊600ul 的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离⼼15min4、吸上清，装⼊⼀新的EP管5、加⼊600ul 氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。
CTAB法提取植物基因组DNA
CTAB法提取植物基因组DNACTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），⼗六烷基三甲基溴化铵，是⼀种阳离⼦去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离⼦强度溶液中沉淀核酸的特性。
当降低溶液盐浓度到⼀定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离⼼就可将其与蛋⽩，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋⽩，多糖，酚类等杂质。
最后通过⼄醇或异丙醇沉淀DNA，⽽CTAB溶于⼄醇或异丙醇⽽除去在⾼离⼦强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋⽩质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加⼊冰冷的植物材料之前必须预热，且离⼼时温度不要低于15℃。
另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。
主要试剂与溶液的配制：PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）巯基⼄醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%⼄醇Tris-苯酚RNaseA⽆⽔⼄醇CTAB 溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量⽢薯新鲜叶⽚，⽤液氮迅速研磨，中间加PVP（聚⼄烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转⼊10mL的离⼼管中，放⼊液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差⼏倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨⼏次）。
CTAB法提取植物总DNA
关于CTAB法提取基因组DNA，原理CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。
缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。
2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
植物DNA的提取与测定
植物DNA的提取与测定一、目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
二、原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
04 实验四 植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.
实验步骤
10mL CTAB分离缓冲液加入50mL 离心管中， 在65℃水浴中预热。 取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中， 倒入液氮，尽快将叶片研碎。 将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲 液中，轻轻转动混匀，65℃保温30分钟。 加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。 室温，4000 rpm离心10分钟。
异丙醇 氯仿-异戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇
TE 缓冲液
10mmol/L Tris-HCL （pH7.4） 1mmol/L EDTA
思考题
本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的 作用是什么？ 吸取样品、抽提应注意什么？为什么？ 提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？
用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干 净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇， 轻轻混匀，使核酸沉淀下来 用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL 70％乙醇中，浸泡洗涤10分钟 用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥 将DNA沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中
DNA纯度和浓度鉴定
取100uL DNA溶液（剩余的DNA溶液放 在-20℃保存），用TE缓冲液稀释20，50 和100倍，测定A260和A280
实验四
植物DNA的提取与鉴定
实验原理
真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的 形式存在于细胞核内 在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细 胞膜，释放出核蛋白
实验原理
在浓氯化钠溶液（1～2 mol／L）中， DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋 白的溶解度很小。
在稀氯化钠溶液（0.14 mol／L）中， DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋 白的溶解度很大。 利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白 或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
十六烷基三甲基溴化铵亲水基
十六烷基三甲基溴化铵亲水基一、引言十六烷基三甲基溴化铵（简称CTAB）是一种常见的阳离子表面活性剂，具有优良的表面活性、乳化性、分散性等性能，广泛应用于各个领域。
本文将对CTAB的性质、应用、制备与纯化、发展趋势等方面进行探讨，以期为相关人员提供参考。
二、十六烷基三甲基溴化铵的基本性质1.分子结构CTAB的分子结构由长链烷基和三个甲基组成，其中一个甲基带有溴原子。
其分子式为C19H40BrN，相对分子质量为309.3。
2.亲水基性质CTAB分子中含有季铵盐基团，具有较强的亲水性。
在水溶液中，CTAB分子会离解成阳离子，与水分子形成氢键，使其具有良好的溶解性。
3.溶解性CTAB在水、醇等极性溶剂中具有良好的溶解性。
随着温度的升高，溶解度逐渐增大。
此外，CTAB在不同浓度的溶液中，溶解度也有所不同。
三、应用领域1.表面活性剂CTAB作为阳离子表面活性剂，具有良好的表面活性，可用于制备洗涤剂、清洁剂等日常用品。
2.乳化剂CTAB在油水体系中具有良好的乳化性能，可用于制备乳液、涂料等产品。
3.分散剂CTAB能有效分散固体颗粒，提高颗粒在水性体系中的稳定性，广泛应用于造纸、陶瓷、建材等行业。
四、产品制备与纯化1.制备方法CTAB的制备方法主要有两种：一是烷基化反应，二是季铵化反应。
烷基化反应是将长链烷基溴化物与氢氧化钠反应生成CTAB；季铵化反应是将长链烷胺与氢氧化钠、溴化钠反应制备CTAB。
2.纯化工艺CTAB的纯化工艺主要包括重结晶、溶剂萃取等。
重结晶是将CTAB溶液加热、冷却、过滤得到纯品；溶剂萃取则是利用CTAB在不同溶剂中的溶解度差异，进行多次萃取以提高纯度。
五、发展趋势与展望1.市场需求随着科技的进步和环保要求的提高，CTAB在各个领域的应用将持续扩大，市场需求不断增长。
2.技术创新为满足环保、节能等要求，CTAB的制备工艺和应用技术将不断优化和创新，包括绿色合成、高效应用等方面。
3.环保要求未来，CTAB的生产和应用将更加注重环保，致力于降低能耗、减少污染，实现可持续发展。
CTAB法提取植物DNA
清洗
• 将上清液再次离心，去除其中的杂质和蛋白质。 将得到的上清液转移到新的离心管中。
DNA的纯化与溶解
在上清液中加入等体积的异丙醇，混 匀后放置一段时间，使DNA沉淀下来。
将清洗后的DNA晾干，然后加入适量 的TE缓冲液溶解DNA。此时可以得到 高质量的植物DNA样品，可用于后续 的实验或保存备用。
利用ctab法提取的DNA进行遗传多样性 分析，有助于了解植物种群的遗传结构和 演化历程。
在植物育种中的应用
分子标记辅助育种
利用ctab法提取的DNA进行分子标 记辅助育种，能够快速准确地鉴定优 良基因型，提高育种效率。
转基因育种
通过ctab法提取的DNA可以用于构建 基因，为转基因育种提供重要的 基因资源。
DNA浓度测定
根据DNA溶液的吸光度值，计算DNA的浓度。
DNA完整性评估
通过电泳检测DNA片段的大小和完整性，评估DNA的质量。
04 ctab法提取植物DNA的 应用与展望
在植物遗传研究中的应用
基因定位
通过ctab法提取的DNA可用于基因定位 ，确定基因在染色体上的位置和功能。
VS
遗传多样性分析
实验过程中的安全注意事项
实验操作安全
在实验过程中，应遵循实验室安全规定，避免交 叉污染和意外事故的发生。
防护措施
佩戴实验服、手套、口罩等防护用品，确保实验 操作人员的安全。
化学品使用
正确使用和处理实验过程中涉及的化学试剂，避 免对实验操作人员造成伤害。
实验结果的判定与评估
DNA纯度检测
通过紫外分光光度计检测DNA溶液的A260/A280值，判断DNA 的纯度。
参考文献3
CTAB法提取植物DNA的步骤包括将植 物组织研磨成粉末，加入预热的缓冲 液和CTAB，混合均匀后进行离心，取 上清液加入乙醇沉淀，离心后取出 DNA进行洗涤和干燥。在提取过程中 需要注意避免交叉污染和样品间的混 淆。
植物基因组dna的提取实验报告
植物基因组dna的提取实验报告植物基因组DNA的提取实验报告。
植物基因组DNA的提取是分子生物学实验中的一项重要步骤，对于研究植物的遗传特性和基因表达具有重要意义。
本实验旨在通过提取植物细胞中的DNA，为后续分子生物学实验提供基础支持。
在本次实验中，我们选择了小麦叶片作为实验材料，采用CTAB法提取植物基因组DNA，并对提取的DNA进行质量评估。
首先，我们收集了新鲜的小麦叶片样品，并将其置于液氮中迅速冷冻保存，以保持DNA的完整性。
接着，将叶片样品磨成细末状，并加入预冷的CTAB提取液中，进行细胞破裂和DNA的溶解。
随后，通过酚/氯仿提取法分离DNA与蛋白质，最终得到DNA的沉淀物。
在实验过程中，我们注意到了一些关键的操作细节。
首先，样品的冷冻保存和研磨过程需要迅速进行，以防止DNA的降解。
其次，在加入CTAB提取液后，充分混合样品并保持恒温，有助于细胞破裂和DNA的溶解。
最后，在进行DNA的沉淀时，需要注意避免将上清液一同转移，以保证提取得到的DNA纯度。
提取得到的DNA样品经过紫外分光光度计检测，结果显示其纯度较高，吸光比值（A260/A280）约为1.8，符合DNA的纯度要求。
随后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳实验，观察到明显的DNA条带，并通过对照DNA分子量标准品的迁移情况，初步评估了提取得到的DNA片段大小。
通过本次实验，我们成功地提取到了小麦叶片样品中的基因组DNA，并对其质量进行了评估。
下一步，我们将利用提取得到的DNA样品，开展进一步的分子生物学实验，包括PCR扩增、基因克隆等，以深入研究小麦的遗传特性和基因表达。
本次实验为我们提供了可靠的DNA样品，为后续实验奠定了坚实的基础。
总之，植物基因组DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，本次实验通过CTAB法成功提取了小麦叶片样品中的DNA，并对其进行了质量评估。
提取得到的DNA样品具有较高的纯度和完整性，为后续实验提供了可靠的基础支持。
改进的CTAB提取植物DNA方法
ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００６，１５１：２５１－２６１．
Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｌａｓ ６６・ ｌｉｎｅｓ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｉｎ
【８］Ｇｕｏ
Ｐ，Ｂａｉ
Ｇ，ｕ
ｄｅｒｉｖｅｄ
ｗｈｅａｔ ｎｅａｒ－ｉｓｏｇｅｎｉｃ
ａｌｕｍｉｎｕｍ（ＡＩ）ｔｏｌ・
第９期
李荣华，等：改进这一技术逐步改进， 如Ｓａｇｈａｉ—Ｍａｒｏｏｆ等研发出十六烷基三甲基溴化铵 （ＣＴＡＢ）法用于提取植物ＤＮＡ”１等，使得ＤＮＡ的提取 相对较为快捷，提取的质量提高。近几年来随着我校 对实验设备大量投入，一批适合于现代生命科学教学 和研究需要的仪器和设备能够满足要求。 在众多的ＤＮＡ提取方法中，发现ＣＴＡＢ法是一种 较为理想的提取植物ＤＮＡ的方法¨１。根据我院实验 室仪器设备的具体情况，我们多次使用ＣＴＡＢ法后发 现，这种方法还可以进一步的改进和完善。在多次指 导学生开展教学和研究活动过程中，总结出一种适合 于我院学生学习和开展研究活动的、操作简便且效果 好的ＤＮＡ提取方法，该方法可以使学生在较短时间获 得理想的实验效果，除了能直接观察到ＤＮＡ的丝状沉 淀外，在琼脂糖电泳中还可确定出所提取ＤＮＡ分子的 大小。
离心５ ｒａｉｎ，继续提取ＤＮＡ。
０００
ＤＮＡ提取缓冲液
根据ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ的原理，配制如表１所示的 ＤＮＡ提取缓冲液。需要注意的是，ＣＴＡＢ和Ｂ一巯基乙 醇不能进行高温灭菌，因此，在配制提取缓冲液之前应 将其他成分进行高温灭菌，之后加入这２项试剂。
表１ ＤＮＡ提取缓冲液（１００ ｍＬ）的配制成分表
ＤＮＡ。
（１１）此步用于要求较高的科研中。一般来讲， ＲＮＡ不影响ＤＮＡ特性的分析，如想获得不含ＲＮＡ的
实验四 植物DNA的提取
实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
利用CTAB法提取植物基因组DNA
利用CTAB法提取植物基因组DNA植物基因组DNA提取是分子生物学领域中常用的技术之一。
目的是为了获取高质量的DNA样品，以便进行PCR、测序、基因克隆以及染色体制备等实验。
目前，CTAB法是植物基因组DNA提取中广泛采用的方法之一。
本文将介绍利用CTAB法提取植物基因组DNA的步骤及注意事项。
1. 准备植物组织样品首先需要准备好待提取的植物组织样品，这些样品可以是叶子、花、芽、根等。
样品应该分别收集、标记，冷藏保存并尽快进行提取。
2. 样品研磨取一小段样品，用液氮将其冷冻，然后用研钵和研杵将其研磨成细碎的粉末状。
如果样品过多，则可以用离心管研磨器等仪器进行批量高效研磨。
3. 细胞壁裂解将磨细的植物组织加入CTAB裂解缓冲液中，加热至65℃，开启混合器磁子，同时混合2-3分钟左右，以破坏细胞壁，释放出DNA。
4. 除去蛋白质加入一定量的氯仿，并短暂的混合均匀，待混合物静置后，可以观察到混合液结成两层。
上层为水相，在此基础上加入同体积的异丙醇，沉淀出DNA进行洗涤和离心。
离心后，上清液含有蛋白质，可以废弃，而下沉淀可以进行枸橼酸溶解。
5. 获取DNA加入枸橼酸缓冲液后，可以分别进行洗涤和沉淀。
最后，通过乙醇提取，可以得到纯度较高的基因组DNA样品。
注意事项：1. 必须严格控制植物组织样品的数量，避免混入过多的杂质干扰提取效果。
2. 在DNA分离过程中，所有试剂、试管和磨具等物品都必须干燥无水，以免水分对提取质量产生干扰。
3. CTAB裂解缓冲液中的NaCl浓度和pH值的调节必须准确，其浓度和pH值直接关系到DNA的结晶和浓度。
4. 在进行DNA纯化过程中，必须注意所有材料的稳定性和纯度，同时要充分保护目标DNA，避免DNA被降解。
总之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种安全、高效、可靠的方法。
在实际操作中，应充分掌握其原理、步骤和注意事项，以获取高质量的DNA样品，为后续的实验打下良好的基础。
实验十二植物中DNA的提取及鉴定
实验十二植物中DNA的提取及鉴定实验十二植物中DNA的提取及鉴定一.实验目的1.学习掌握从植物中提取DNA的方法2.学习掌握从植物中分离核酸的原理和方法二.实验原理Ⅰ植物基因组DNA 的提取（CTAB法）植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。
（2）抑制内外源DNase的活力。
DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。
（3）防止化学降解。
如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。
（4）防止物理因素降解。
如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。
植物基因组DNA的提取
浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7. [2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6. [3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社， 2006，5. [4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京 ：化学工业出版社，2006，2.
3、方法与步骤
①
②
在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解 ，充分混匀后使用）； 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
3、方法与步骤
4、注意事项
CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以
使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）； 在研磨前，研钵里不得有任何水分 ，否则加液氮时容易结冰； 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
4、注意事出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层； 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
植物DNA的提取与鉴定
5，置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min 轻轻摇动，30~60min后取出； 6，冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1） 至满管，充分混匀2~3 min 7，放入离心机中10000 rpm离心10 min，与此 同时，将600 ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心 管中； 8， 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸 取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心 管慢慢上下摇动30 s，使异丙醇与水层充分混合 至能见到DNA絮状物；
,
思考
1. 用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时 , 由于蛋白与 DNA 联结键已断 , 蛋白分 子表面又含有很多极性基团与苯酚 相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。
2.氯仿的作用？ 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的迹量 酚。（酚易溶于氯仿中） 3.异戊醇的作用？
①化学因素，核酸的结构在 pH 值 4.0 — 11.0 间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性 降解，故制备过程应避免过酸过碱。
②物理因素， DNA 分子链很长，是双螺旋结 构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故 强机械作用如剧烈搅拌会令 DNA 分子断裂酶 在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来， 它会降解DNA 分子。故须用酶的变性剂、 抑制剂使之失活。操作过程最好在低 温(0℃左右)下进行。 2 ，所有操作均须温和，避免剧烈震荡。
170乙醇液氮70乙醇液氮实验器材冷冻高速离心机台式高速离心机移液器水浴锅37100陶瓷研钵离心管50ml有盖离心管5ml和15ml小玻棒形状为弯成钩状的天平冷冻高速离心机台式高速离心机移液器水浴锅37100陶瓷研钵离心管50ml有盖离心管5ml和15ml小玻棒形状为弯成钩状的天平实验步骤1将10mlctab提取缓冲液加入50ml离心管中置于60水浴中预热
ctab法提取植物基因组dna[指点]
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ctab法提取植物基因组dna[指点] CTAB法提取植物基因组DNA这种方法是由Murray 和Thompson(1980)修改而成的简便方法。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中((0.7 mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
一材料、试剂和仪器1 材料新鲜的组织材料或-80?冻存的材料2 试剂(1)2×CTAB溶液(2)氯仿/异戊醇(24:1)(3)RNaseA 10mg/ml(4)乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇(6)氯仿/异戊醇(25/24/1)(7)70%乙醇3. 仪器: 离心机，恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置二、实验程序1.在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB和20 μlβ-巯基乙醇, 65?预热。
2嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddHO冲洗2次，放入经液氮预冷的研2钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65?水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。
注:冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。
而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。
3加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。
4向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置37?20-30min。
5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20?放置30 min或-80?放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。
6 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。
十六烷基三甲基溴化铵ph检测方法
十六烷基三甲基溴化铵ph检测方法
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）是一种阳离子表面活性剂，常
用于生物化学实验室中。
在进行CTAB的pH检测时，可以采用以下
方法：
1. pH试纸法，将pH试纸条浸泡在含有CTAB的溶液中，根据
试纸变色来判断溶液的pH值。
这种方法简单快捷，适用于快速初步
判断溶液的酸碱性，但精确度较低。
2. pH计法，使用数字式pH计仪器，将电极插入CTAB溶液中，通过仪器显示的数字读数来确定溶液的pH值。
这种方法精确度高，
适用于科研实验室和工业生产中对溶液pH值精确要求较高的情况。
3. 酸碱滴定法，使用酸碱滴定法来测定CTAB溶液的pH值。
首
先将CTAB溶液加入酸碱指示剂，然后滴加酸碱溶液直至指示剂的颜
色发生转变，记录所需的酸碱溶液用量，根据滴定结果计算出溶液
的精确pH值。
在进行pH检测时，需要注意以下几点：
确保使用的pH试纸、pH计或滴定试剂的准确性和灵敏度。
在进行pH检测前，确保CTAB溶液充分搅拌均匀，以确保取样的均匀性。
在进行pH检测时，注意安全操作，避免溶液溅出或接触皮肤和眼睛。
总的来说，针对十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的pH检测，可以根据实际需求选择合适的方法进行检测，并严格遵循操作规程，确保检测结果的准确性和可靠性。
植物组织DNA的提取和鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定实验目的1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。
2.了解CTAB的成分及作用。
3.学习PCR的原理并掌握其方法。
4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。
实验原理植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。
T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
PCR基本原理：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的DNA 片段。
CTAB配方及植物DNA提取方法
CTAB配方及植物DNA提取方法主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。
加入7 mL 10 mo1/L NaOH 调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。
（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。
（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。
（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。
（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。
（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80 mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min。
4℃保存。
（7）3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL 的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。
4℃保存。
（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2％β-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。
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植物DNA的提取与鉴定
实验原理
真核生物的DNA与组蛋白结合，以DNA核
蛋白的形式存在于细胞核内。
在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细 胞膜，释放出DNA/L NaCl中，DNA核蛋白的溶
解度大，RNA核蛋白的溶解度小。
在0.14 mol/L NaCl中，DNA核蛋白溶解 度小，RNA核蛋白溶解度大。
提取DNA的量：0.75-2.5 mg；
质量鉴定：A260/A280比值1.80-2.00，合格。
紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度
核酸的紫外吸收260 nm，蛋白质280 nm
DNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.0 50 ug/mL DNA溶液，A260 = 1.0 40 ug/mL RNA溶液，A260 = 1.0
实验步骤
将10 mL CTAB提取液加入50 mL 离心管中，在 65℃水浴中预热； 约50 g（全班共用）植物叶片，置于预冷的研钵中， 倒入液氮，充分研磨10 min； 每组取2-3 g叶片粉末，加入预热的CTAB提取液中， 混匀，65℃保温30 min； 加10 mL氯仿-异戊醇，轻柔充分振荡3-5 min。 5000 rpm离心5 min。
用紫外分光光度计测定A260和A280；
计算DNA的含量； 鉴定DNA的纯度。
试 剂
CTAB提取液
2.0% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）
1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 0.2% 巯基乙醇
CTAB
CTAB是阳离子去污剂，能使蛋白质变性， 还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物。
思考题
本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇、
Tris各有什么作用？
吸取样品、抽提时应注意什么？为什么？
在提取DNA时，有哪些方法可以除去蛋 白质？
实验结果（2015）
2-3勺充分磨碎的小白菜叶片；
提取的DNA溶于100 mL TE；
测定：A260值0.15-0.50； 浓度：7.5-25 ug/mL；
去除蛋白质的方法
①氯仿-异戊醇使蛋白质变性，离心除去变
性蛋白；
②十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，
与核酸分离，从材料中提取出DNA； ③苯酚使蛋白变性，离心分层，后者停留 在酚层内。
破坏DNA完整结构的因素
①化学因素：pH4.0-11.0稳定，否则变性
降解； ②物理因素：DNA是长链线状分子，机械 剪切作用会使分子断裂； ③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。
用塑料滴管将上清吸入另一支50 mL离心管中，加 入等体积的异丙醇，轻柔充分混匀，静置5 min； 用玻棒将絮状DNA沉淀搅起，置于10 mL 70％乙 醇中浸泡5 min；（如果沉淀量很少，5000 rpm离 心5 min，弃上清，用 10 mL 70％乙醇中浸泡沉淀
5 min）
将DNA沉淀在室温干燥5-8 min； 将DNA沉淀溶于100 mL TE缓冲液中；
核酸-CTAB复合物可溶于 ≥ 0.7 mol/L NaCl的高盐溶液。
液氮：研磨 氯仿-异戊醇（24:1）：蛋白质变性 异丙醇：沉淀DNA 70%乙醇：脱盐
TE缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl （pH7.4） 三羟甲基氨基甲烷，维持弱碱性 1.0 mmol/L EDTA
抑制DNA酶活性