04 实验四 植物DNA的提取和鉴定(十六烷基三甲基溴化铵,CTAB)

紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度

核酸的紫外吸收260 nm，蛋白质280 nm
DNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.0 50 ug/mL DNA溶液，A260 = 1.0 40 ug/mL RNA溶液，A260 = 1.0



实验步骤
将10 mL CTAB提取液加入50 mL 离心管中，在 65℃水浴中预热； 约50 g（全班共用）植物叶片，置于预冷的研钵中， 倒入液氮，充分研磨10 min； 每组取2-3 g叶片粉末，加入预热的CTAB提取液中， 混匀，65℃保温30 min； 加10 mL氯仿-异戊醇，轻柔充分振荡3-5 min。 5000 rpm离心5 min。

核酸-CTAB复合物可溶于 ≥ 0.7 mol/L NaCl的高盐溶液。
液氮：研磨 氯仿-异戊醇（24:1）：蛋白质变性 异丙醇：沉淀DNA 70%乙醇：脱盐
TE缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl （pH7.4） 三羟甲基氨基甲烷，维持弱碱性 1.0 mmol/L EDTA
抑制DNA酶活性
去除蛋白质的方法
①氯仿-异戊醇使蛋白质变性，离心除去变
性蛋白；
②十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，
与核酸分离，从材料中提取出DNA； ③苯酚使蛋白变性，离心分层，后者停留 在酚层内。
破坏DNA完整结构的因素
①化学因素：pH4.0-11.0稳定，否则变性
降解； ②物理因素：DNA是长链线状分子，机械 剪切作用会使分子断裂； ③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。
提取DNA的量：0.75-2.5 mg；
质量鉴定：A260/A280比值1.80-2.00，合格。
思考题
本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇、
Tris各有什么作用？
吸取样品、抽提时应注意什么？为什么？
在提取DNA时，有哪些Hale Waihona Puke Baidu法可以除去蛋 白质？
实验结果（2015）
2-3勺充分磨碎的小白菜叶片；
提取的DNA溶于100 mL TE；
测定：A260值0.15-0.50； 浓度：7.5-25 ug/mL；
实验四
植物DNA的提取与鉴定
实验原理

真核生物的DNA与组蛋白结合，以DNA核
蛋白的形式存在于细胞核内。

在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细 胞膜，释放出DNA核蛋白。
实验原理

在1.4 mol/L NaCl中，DNA核蛋白的溶
解度大，RNA核蛋白的溶解度小。

在0.14 mol/L NaCl中，DNA核蛋白溶解 度小，RNA核蛋白溶解度大。
用塑料滴管将上清吸入另一支50 mL离心管中，加 入等体积的异丙醇，轻柔充分混匀，静置5 min； 用玻棒将絮状DNA沉淀搅起，置于10 mL 70％乙 醇中浸泡5 min；（如果沉淀量很少，5000 rpm离 心5 min，弃上清，用 10 mL 70％乙醇中浸泡沉淀
5 min）
将DNA沉淀在室温干燥5-8 min； 将DNA沉淀溶于100 mL TE缓冲液中；
用紫外分光光度计测定A260和A280；
计算DNA的含量； 鉴定DNA的纯度。
试 剂
CTAB提取液
2.0% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）
1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 0.2% 巯基乙醇
CTAB

CTAB是阳离子去污剂，能使蛋白质变性， 还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物。