实验一蛋白质含量测定
实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定
实验一动物细胞蛋白质的提取和含量测定实验目的：学习动物细胞蛋白质的提取方法，并利用比色法测定蛋白质含量。
实验原理：蛋白质是生物体中丰富的一类生物大分子，广泛分布于细胞内和细胞外，并参与生物体内多种生命过程。
动物细胞蛋白质的提取是分离蛋白质与其他细胞成分的过程，主要包括以下步骤：细胞破碎、离心、过滤、沉淀、溶解等。
比色法是常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理为：在一定条件下，吸收光谱的特定波长处与蛋白质浓度成正比关系，当分子光吸收强度与物质的摩尔吸光系数（ε）和浓度（c）成比例时，吸收光强度与摩尔浓度成正比。
实验材料：鼠肝组织（或其他动物细胞）、PBS缓冲液、离心管、低速离心机、高速离心机、比色皿、分光光度计、升酸钠（NaOH）、双氧水（H2O2）、标准蛋白溶液。
实验步骤：1.将肝组织切碎并加入PBS缓冲液中，用器皿以适量缓慢但均匀的方式搅拌，使细胞尽可能充分破碎，制成15%（w/v）的组织均浆。
2.将组织均浆经低速离心（1000×g，5分钟）离心去除大的组织碎片和细胞核，得到上清液。
3.取出上清液，经高速离心（12000×g，10分钟）离心，得到上清液中的细胞蛋白质沉淀。
将上清液去除，并将沉淀用PBS缓冲液洗涤2-3次。
4.将蛋白样品溶解在PBS溶液中，并将其含量测量。
用比色法测量蛋白质的含量。
5.将一定量的标准蛋白质溶液（如蛋白质量为0.5mg/ml）放入比色皿中，取等体积的PBS作为对照。
将吸收光谱测试于580nm光波下。
6.将需要测定的试样溶液（不稀释或稀释到正常范围内）的吸光度值与标准曲线进行比较，并评估试样的蛋白质含量。
实验注意事项：1.组织均浆可以通过超声波等方式进行更好的细胞破碎。
2.在高速离心前，一定要充分清除离心管内假底残留的上清液及杂物。
3.比色法中，在标准曲线制备过程中，须注意所有物品洁净，不受污染。
标准品配制同样须严格控制。
实验结果：在蛋白质提取和测定后，实验者可计算并评估其蛋白质含量。
蛋白质的含量测定实验
蛋白质的含量测定实验蛋白质是构成生物体的重要有机分子之一，对于了解生物体的组成和功能具有重要意义。
在科学研究和食品加工等领域，准确测定蛋白质的含量是十分关键的。
本实验将介绍一种常用的蛋白质含量测定方法——低里氏法。
一、材料与试剂准备1. 组织样本：可以选择动植物组织，如肝脏、肌肉等。
2. 水浴锅：用于加热试剂，保持温度恒定。
3. 显色试剂：选择低里氏试剂，常见的有Bradford显色试剂。
4. 蛋白质标准溶液：根据需要选择适当浓度的蛋白质标准溶液，常用的有Bovine Serum Albumin（BSA）标准溶液。
5. 常用实验器材：包括离心管、移液管、离心机、比色皿等。
二、实验步骤1. 样本制备：a. 提取组织样本：取适量的组织样本，如肝脏、肌肉等，使用离心机将其离心，去除杂质和溶液。
b. 重建组织样本：向组织样本中加入一定体积的溶液，使样本浓度适宜，便于后续的测定。
2. 样本处理：a. 取相同体积的样本和蛋白质标准溶液，分别加入离心管中。
b. 添加适量的显色试剂，轻轻摇匀，使样本和标准溶液均匀与显色试剂充分接触。
c. 将离心管放入水浴锅中，调节温度为适宜条件，如常温或37℃。
d. 静置一段时间，使显色反应充分进行。
3. 比色测定：a. 取适量的显色反应液，加入比色皿中。
b. 使用光密度计或分光光度计，以试剂空白对照为基准，测定各个样本的吸光度。
c. 根据吸光度的读数，结合标准曲线，计算出样本中蛋白质的含量。
三、数据分析与结果解读根据实验的结果，我们可以得到样本中蛋白质的含量。
通过对不同样本的测定，可以比较不同组织或不同处理条件下蛋白质含量的差异。
同时，通过与蛋白质标准溶液的比较，可以验证测定方法的准确性和可靠性。
实验结果的解读应根据具体情况进行。
如果是在科学研究中，可以将结果与已有文献进行比较，探讨其在生物体功能或代谢方面的意义。
如果是在食品加工中，可以根据蛋白质含量的测定结果来评估食品的营养价值和质量。
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告
实验目的：测定样品中蛋白质的含量。
实验原理：
蛋白质是生物体中重要的营养成分，其含量的测定对于食品、生物化学研究等都具有重要意义。
本实验采用双氧水法测定蛋白质的含量。
双氧水法原理是将双氧水与被测物中的蛋白质发生氧化反应，生成到氨基酸的过氧化氢，过氧化氢再与钼酸铵生成深蓝色化合物。
根据形成的深蓝色化合物的吸光度与蛋白质的含量成正比关系，可以通过比色法测定样品中蛋白质的含量。
实验步骤：
1. 将待测样品和标准蛋白质溶液分别取1ml到不同的试管中。
2. 加入4ml双氧水试剂，混匀。
3. 在室温下放置20分钟。
4. 加入适量的硫酸试剂，混匀。
5. 在60℃水浴锅中恒温加热10分钟。
6. 冷却至室温。
7. 分别将标准蛋白质溶液和待测样品溶液吸取1ml到比色皿中。
8. 用比色皿中的溶液分别测定吸光度，以比色皿中双氧水试剂为参比。
9. 根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验结果：
根据吸光度测定值和标准曲线得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
实验讨论：
蛋白质的含量测定是一项常见的实验，通过双氧水法可以快速准确地测定样品中蛋白质的含量。
在实验过程中，应注意操作的准确性和实验条件的控制，避免测定误差的产生。
此外，标准曲线的制备和测定结果的分析也是关键步骤，应进行仔细的处理和验证。
实验结论：
经过测定，得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
实验一 考马斯蛋白质含量测定
实验一考马斯亮蓝蛋白质含量测定一、实验目的1、验证对于微量移液器操作技术的掌握技术；2、结合实验结果，找出不足之处，通过实践训练以达到微量移液器操作规程的要求。
二、实验原理利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
三、实验方法方案一：酶标仪测定实验材料：96孔板，移液器及吸头，考马斯亮蓝G250染色液，稀释液，蛋白质标准溶液，酶标仪实验方法：1、按顺序在96孔板内加入相应体积的稀释液、蛋白质标准溶液或样品溶液。
考马斯亮蓝蛋白质含量测定2、各孔加入200µlG250染色液，室温反应3分钟。
3、设定1号管为空白孔，用酶标仪测定各孔OD59值并打印测定结果。
方案二：分光光度计测定实验材料：移液器及吸头，考马斯亮蓝G250染色液，稀释液，蛋白质标准溶液，试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计实验方法：一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液1. 标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。
2. 待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀释200倍。
三、器材试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。
生化实验 实验一：蛋白质含量测定方法的研究
实验一：蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景：目前常用的蛋白质含量的定方法有四种：凯氏定氮，Folin-酚法，考马斯亮蓝法，紫外法。
几种方法各有各自的优势和精确度，根据不同的材料应选择不同的检测方法。
二、研究目标：通过对不同测定蛋白质含量方法的比较，找出实际实验操作中针对不同底物的最佳选择。
三、研究策略：对同样的蛋白质样品，用紫外法，Folin-酚法，考马斯亮蓝法四种方法进行测定，再向蛋白质样品中分别加入酪氨酸，EDTA ，嘌呤，再用三种方法进行测量，再将测量结果进行比较。
四、研究方案及可行性分析：经过上周的讨论以及老师的分析，我们必须绕过“标准浓度”这个判定方法，因此用增大杂质的影响的方法进行比较。
在生物样品中分别加入不同杂质，再进行测量，受某种杂质影响较大的实验方法测量出的结果必然会与另两个的结果有较大的偏差，因此可以比较出在不同非蛋白质杂质对不同测量方法的影响，因此可以作为日常实验中的选择依据。
五、具体实验设计1.试剂与仪器（1）试剂：标准牛血清蛋白溶液，1mg/ml；考马斯亮蓝G-250；乙醇；磷酸（85%）；试剂甲：10g碳酸钠，2g氢氧化钠，0.5g酒石酸钾钠溶解后用蒸馏水定容至500ml；0.5g五水硫酸铜溶解后，用蒸馏水定容至100ml；试剂乙：1NFolin--酚试剂(乙)；蛋白质样品：绿豆芽下胚轴；EDTA0.05g，饱和酪氨酸溶液1ml；嘌呤溶液1ml（2）仪器紫外分光光度计；移液管0.5*1,1ml*2,5ml*1；试管和试管架；722型分光光度计；恒温水浴；具塞刻度试管：15ml*8；小烧杯2个，漏斗及架；分析天平，容量瓶，研钵；离心机，药物天平；量筒10ml*1,刻度吸管：1ml*2,0.1ml*2，剪刀2.具体操作步骤与原始数据记录（1）紫外法测定蛋白质含量：按下表配制溶液→1cm石英比色杯测光密度值→绘制标准曲线→1g绿豆芽下胚轴研磨→50ml容量瓶定容，过滤，取滤液为样品A1→重复上步3次，在滤液中分别加入EDTA,酪氨酸溶液，嘌呤溶液，标记为乙试剂→半小时后650nm下比色→绘制标准曲线→按步骤(1)制取相同绿豆芽下胚轴滤→595nm下比色→绘制标准曲线→按步骤（1）制取样品，标号A3，B3，C3，六、质疑及相关思考对于测定蛋白质含量的实验，是否需要做几组平行实验？如果全部都做平行实验，则实验量过大，是测量程序变得复杂，参考书上的资料，也不是全部都有平行组。
实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法
营养技能实训指导≤烹饪营养与安全≥课程组福州黎明职业技术学院药学系2007年02月目录1、实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）2、实训二食物中脂肪含量的测定（索氏抽提法）3、实训三荧光法测定食物中维生素B24、实训四大学生食谱编制与计算5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计7、实训七厨房用具砧板的卫生调查（细菌菌落总数测定）8、实训八厨房卫生调查（大肠菌群快速检测法）实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 ——1.0mL 盐酸[c(HCl) 1.000mol / L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m——样品的质量（g）；F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过测定食物中蛋白质含量的方法，掌握蛋白质的测定原理和操作技能，加深对蛋白质的认识，为日常饮食提供科学依据。
二、实验原理。
本实验采用了比色法测定蛋白质含量。
比色法是根据蛋白质与双酚类物质在碱性条件下生成紫色化合物的原理，利用紫外可见光谱法测定其吸光度，从而计算出蛋白质的含量。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将食物样品研磨成粉末状。
2. 蛋白质提取，取适量样品加入提取液，振荡离心，收集上清液。
3. 比色反应，将提取液与试剂混合，待反应完成后进行测定。
4. 吸光度测定，用紫外可见光谱仪测定吸光度。
5. 计算蛋白质含量，根据吸光度值计算出样品中蛋白质的含量。
四、实验结果。
经过实验测定，得出食物样品中蛋白质含量为Xg/100g。
五、实验分析。
通过本次实验，我们了解了蛋白质含量测定的原理和方法，掌握了比色法测定蛋白质含量的操作技能。
同时，也发现不同食物样品中蛋白质含量的差异，为我们科学合理地进行日常饮食提供了参考。
六、实验总结。
蛋白质是人体生命活动的重要组成部分，合理摄入足够的蛋白质对维持身体健康至关重要。
通过本次实验，我们不仅学会了测定蛋白质含量的方法，也增加了对蛋白质的认识，为我们的健康饮食提供了科学依据。
七、实验感想。
本次实验让我深刻认识到蛋白质在日常饮食中的重要性，也让我对科学实验有了更深的理解和体会。
希望通过今后的学习和实践，能够更好地运用所学知识，为自己和他人的健康提供帮助。
八、参考文献。
1. 《食品分析实验指导》，XXX，XXX出版社，XXXX年。
2. 《食品化学与分析》，XXX，XXX出版社，XXXX年。
以上就是本次蛋白质含量测定实验的报告内容，希望对大家有所帮助。
实验蛋白质含量测定
实验一 几种蛋白质定量测定方法的比较
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单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅的阐述观点。
生物化学与分子生物学基础实验
实验目的
掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法 掌握分光光度计的原理和使用方法
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。
280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差别很大(图1)。
生物化学与分子生物学基础实验
选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：
有多少样品可供分析; 蛋白质样品浓度大约是多少; 样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； 所选方法是否简单、可靠； 含量测定的专一性要求是否很高。
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。
03
单击此处添加小标题
Folin-酚试剂乙
05
单击此处添加小标题
未知蛋白溶液
生化实验-蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验实验一双缩脲法测定蛋白质含量一．实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。
二．实验原理在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
三．实验仪器及试剂容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml③小鼠肝脏蛋白原浆四．实验内容（1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
（3）按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。
五.实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。
实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一．实验目的掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
二．实验原理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。
三．实验仪器及试剂仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围（μ 不同种类最大吸收波方法特点g/ml）蛋白的差异长nm 标准方法，准确，操作麻烦，费时，凯氏定氮法小灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物100—1000 大280205 度法质有影响重复性、线性关系好，灵敏度低，测双缩脲法1000—10000 小540 定范围窄，样品需要量大Folin-酚试20—500 大750 灵敏，费时较长，干扰物质多剂法考马氏亮蓝灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会50—500 大595 G-250 转移灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时BCA 50—500 大562 较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
实验一蛋白质含量测定方法的研究
实验⼀蛋⽩质含量测定⽅法的研究⽣物化学实验预习报告实验⼀蛋⽩质含量测定⽅法的研究⼀、研究背景蛋⽩质含量的测定⼴泛应⽤于⽣产实践、医药卫⽣等各个领域，如测定⽜奶等⾷品中蛋⽩质的含量作为其营养成分的参考值，测定病⼈尿液中蛋⽩质的含量以检测其是否患有某种疾病等，因⽽测定蛋⽩质的含量具有⾮常重要的意义。
由于蛋⽩质本⾝具有⼀系列的特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与某些染料结合等），利⽤它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理⼿段，将⼀定量的蛋⽩质转化为可以⽅便定量测定的其他量，从⽽达到测定蛋⽩质含量的⽬的。
蛋⽩质诸多特点的存在决定了它会有不同的测定⽅法，同时由于多种⾮蛋⽩组分的存在和⼲扰以及各种⽅法本⾝的局限性（适⽤条件），每⼀种测定⽅法都有各⾃的优缺点，某⼀种⽅法并不能在任何条件下适⽤于任何形式的蛋⽩质，所以多种测定⽅法的共存是有意义的。
⽬前常⽤的蛋⽩质含量测定⽅法有四种：凯⽒定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法，其中后三种⽅法最常⽤。
在实际⼯作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋⽩质的种类与性质、溶液中存在的⼲扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使⽤某种⽅法。
⼆、研究⽬标1.掌握常⽤的蛋⽩质含量测定⽅法的原理和操作流程；（基础⽬标）2.了解不同测定⽅法的优点和局限性，掌握在实际⼯作中不同测定⽅法的选择条件；（基础⽬标）3.证明⾮蛋⽩组分在蛋⽩质含量测定中存在⼲扰，并通过分析实验结果确定该⼲扰在实际⼯作中是否可以忽略。
（⾼级⽬标）三、研究策略本实验最重要的⽬的是为了确定⾮蛋⽩组分在蛋⽩质含量测定中存在的⼲扰是否可以忽略。
思路有两种：⼀种⽅法是先测定纯蛋⽩质溶液中蛋⽩质含量，随后在该溶液中加⼊⾮蛋⽩组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等⾦属离⼦，⽆机酸或⽆机碱，甚⾄某些⾊素等），测定此时蛋⽩质含量，对⽐两次测定结果，计算相对误差，从⽽得出⾮蛋⽩组分的影响程度；另⼀种⽅法是直接使⽤天然的蛋⽩质粗提取物（含有⾮蛋⽩组分，并将其中包含的所有⾮蛋⽩组分看成⼀个影响因素），来测定粗提取物中的蛋⽩质含量。
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定——Folin-酚法一、目的要求（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理（一）蛋白质定量测定的方法目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。
这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。
（二）Folin—酚法原理1.原理Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250ug蛋白质2.优缺点目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。
缺点是此反应受多种因素干扰。
在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。
此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。
实验一蛋白质含量的测定
❖ 该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量(范 围为5～100μg蛋白质）,，所以是一种比较好 的蛋白质定量法。
二、材料、试剂与仪器设备：
❖ 植物材料：各种植物叶片及其他器官或离体 细胞培养物 实验器具：分光光度计；离心机；研钵； 离 心管；移液管，试管等；
实验目的
❖ 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种 代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢 的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时， 常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活 力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内 可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
一、原理
❖ 考马斯亮蓝G-250（Coomassit brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一 种。在一定蛋白质浓度范围内（5～ 100μg/ml），蛋白质－色素复合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可 用于蛋白质的定量测定。
试 剂 1．考马斯亮蓝试剂： 2．蛋白质标准溶液： 3．90%乙醇； 4.磷酸（85%，W/V）。
三、实验步骤
❖ 样品含量测定： ❖ （1）称取鲜样0.5g，剪碎放入研钵中加少量
pH7.0缓冲液3ml研磨提取,再分别加2ml,1ml 清洗研钵和研棒两次,倒入离心管中， 7000rpm/min离心15分钟,把上清液倒入一刻 度试管中,记录体积。
❖ 式中： C－查标准曲线所得每管蛋白质含量 （µg /mL）；
❖ V－提取液总体积（mL）； ❖ a－测定所取提取液体积（mL）； ❖ W－取样量（g）。
五、注意事项
1.在配制考马斯亮蓝时很容易看到絮状物出现， 应用滤纸加以过滤，以免影响测定结果。
生化实验01-蛋白质含量的测定
1.0mL
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
0
5mL，混匀后室温下放置5~10min
0.5mL（逐一加入并立即混匀），20~30min后，测定
A650
6
比色测定：
1号管为空白，在650nm波长下用10mm光程的比色皿测定各管 的吸光度。
标准曲线绘制：
以每管标准蛋白含量（μg）为 横坐标，吸光度（A650）为纵坐标 ，在坐标纸上绘制出标准曲线。
-3
T1
T1
T1
-1
-2
-3
3个技术重复
T2
T2
T2
-1
-2
-3
T3
T3
T3
-1
பைடு நூலகம்
-2
-3
9
五、原始数据
A650的记录
管号
12 34 5
标准蛋白 0 50 100 150 200
含量 (μg)
A650
W=
VT=
VS=
测定-1 测定-2 测定-3
N=
10
六、结果计算
• 标准曲线的绘制： 1、坐标纸绘制 2、在excel中绘制并求
出回归方程
A650
0.3 0.2 0.1
50 100 150 200
蛋白质含量（ μg ）
11
X：根据样品的吸光值查得的蛋白质含量（ μg ）； X1= , X2= ，X3= ，X平均=
12
样品中蛋白质的含量（mg/g）＝
X VT N W VS 1000
X：根据样品的吸光值查得的蛋白质量（μg）； VT：提取液总体积（mL）； Vs：测定时取用的样品体积（mL）； W：样品鲜质量（g）； N：样品稀释倍数）
实验一蛋白质含量的测定
2NH3+ H2SO4(NH4)2SO4(2)
(NH4)2SO4+ 2NaOH2H2O +Na2SO4+ 2NH3(3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）
用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法）
灵敏度低
1～20mg
中速
20~30分钟
多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物
硫酸铵；
Tris缓冲液；
某些氨基酸
用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
紫外吸收法
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=C C=O
HN NH
（250g/ml）
未知蛋白质0.2 0.4 0.6
（约250g/ml）
蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 00.8 0.6 0.4
试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙0.5 0.50.50.50.50.50.50.50.50.5
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
双缩脲法实验一蛋白质含量测定
6 1.2
0.8 1.0 5.0
0.0
2.0 1.0 5.0
五 操作
3.2.2 样品浓度测定 吸1 mL多糖液分别用蒸馏水稀释到100倍后， 再取1mL稀释到100倍，待用。 取2mL稀释后的多糖溶液，加入1 mL5%苯酚 混匀,迅速加5mL浓硫酸,振摇5 min,室温静 止显色20 min,于490 nm处进行比色测定, 将所得的吸光度值代入回归方程,得到多糖 浓度。
五、操作
2、平菇多糖的分离纯化
将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖
液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，
在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，
将烧杯中的溶液放在离心管中，在
4000r/min条件下离心15min，得到平菇多
糖沉淀。
五 操作
3、平菇多糖的鉴定
离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用
3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离
子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白 质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应：大分子跑得慢，小分子跑得快 (3)电荷效应 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝 胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因 素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDSPAGE测定蛋白质分子量。
实验一-双缩脲法测定蛋白质含量
实验一:双缩脲法测定蛋白质含量一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。
二原理双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。
在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。
其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。
tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。
在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。
反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。
将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。
由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。
三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）。
四试剂1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。
将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。
此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。
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实验一蛋白质含量的测定
姓名：mangogola
一．实验原理
生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。
该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。
根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。
Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。
该方法灵敏度较高，但较费时。
对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。
原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。
此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。
需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。
二．实验过程（Lowry法）
1.溶液配制
A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。
（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确）
B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。
C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。
D液：Folin试剂
标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液
2.标准曲线测定
按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。
取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋
测得未知蛋白溶液的A500为0.076；0.070，平均值为0.073。
三．数据处理
A 500
软件拟合出的直线方程为：Y=7.17278E-4*X-6.73208E-4，R 2=0.99803，说明拟合效果比较好。
将未知蛋白溶液的A500平均值Y=0.073带入，计算得未知蛋白溶液的浓度为102.7 ug/ml 。
四．注意事项及分析
1.因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但实验中还原反应只在pH=10的情况下发生，所以将Folin 试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前发生还原反应。
2.添加蛋白溶液和试剂时尽量使用同一支移液枪，以减小误差。
3.测量吸光度时按蛋白浓度递增的顺序进行测定，这样可略去洗涤比色皿的步骤。
但测定未知蛋白溶液时要清洗并润洗比色皿。
4.预测本实验得出的结果是偏低的，由于所用比色皿较大，没有多余溶液用来润洗，所以造成了一定程度的稀释，造成结果偏低。