Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告

生物化学实验报告
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生物化学与分子生物学实验教学中心
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一、实验目的
1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理
Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。

为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。

1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白
质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意
1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml ）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头
2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。

表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤
② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。

40℃水浴加热10min 后，冷却至室温。

③ 用V-1100型分光光度计以500nm 波长比色，用1号管做空白，测量各管吸光度值并记录，每管测量3次。

④ 数据处理，绘制标准曲线，计算实验结果。

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

1、结果
① 实验现象：
1) 加入蒸馏水、蛋白样品和碱性硫酸铜溶液后，溶液均呈无色。

2) 加入Folin-酚试剂后，溶液均呈黄色。

试剂（ml ） 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 - 样品液（稀释300倍）
- - - - - 0.5 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 碱性硫酸铜溶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质的含量（μg/ml ）
40
80
120
160
待测
图1水浴前各试管溶液颜色
3)水浴后，1号试管溶液呈无色。

2号试管到5号试管溶液呈蓝色，且颜色逐渐加深。

6号试管溶液颜色介于4号与5号之间，更接近于5号。

图2水浴后各试管溶液颜色
②实验数据记录与分析
各管A值
测定次数
2 3 4 5 6
1 0.050 0.088 0.128 0.144 0.142
2 0.049 0.085 0.125 0.144 0.142
3 0.047 0.08
4 0.124 0.143 0.142
各管平均值0.049 0.086 0.126 0.144 0.142
表格2 500nm波长吸光度值记录
表格 3 绘制标准曲线数据表
标准曲线图
③ 实验结果计算：由标准曲线图可得，标准曲线方程为y=0.001x 。

由实验测得样品管（6号试管）的吸光度为0.142，即y 6=0.142，代入标准曲线方程中可求得C 6’=0.142/0.001=142μg/ml 。

即样品管中的蛋白质浓度为142μg/ml 。

由于血清被稀释了300倍，在实验中根据化学定量原则再稀释2倍。

因此，健康人血清中蛋白质浓度C 6=142*300*2=85200ug/ml=85.200g/L 。

最终通过实验测得健康人血清中蛋白质浓度为85.200g/L 。

2、分析
① 最终实验结果超出正常范围（正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L ）。

可能的原因有：
1）酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,导致蛋白质偏高。

1 2 3 4 5 C （μg/ml ） 0 40 80 120 160 A （吸光度）
0.049
0.086
0.126
0.144
2）实验操作不当。

3）从标准曲线图来看，前四个点基本在一条直线上，第五个点偏差较大。

由此猜测第五支试管的吸光度误差较大，导致实验结果偏大。

4）第五、六支试管与前四支试管所使用的分光光度计不是同一台，而分光光度计是一种精密仪器，更换仪器会导致吸光度测量上有较大误差。

5）显色时间控制存在误差，各个样品的比色时间也无法完全一致。

6）取用蛋白质溶液可能不完全均匀，对结果造成影响。

7）试管可能未完全干燥，使标准液浓度不准确。

②由标准曲线图可知，在一定的浓度范围内，吸光度值和蛋白质的浓度呈现正比例的关系。

即在一定的范围内，蛋白质浓度越高，蓝色越深，吸光度值越大。

通过这种正比例的关系，可以采用比色分析法，即通过测量待测液的吸光度值来获得蛋白质的浓度。

③Folin-酚试剂法的优点有：1）灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍。

2）操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。

④Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而试管中加入碱性硫酸铜试剂后导致溶液呈碱性，Folin-酚试剂不稳定。

因此，Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，应该立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

⑤从正常人血清蛋白浓度范围来看，样品管中的蛋白质浓度大约在
100~133.33μg/ml，因此颜色深度大概在三号试管与五号试管之间。

⑥本次实验采用浓度梯度法，反应体系设置了一支空白管，四支标准管（蛋白质浓度以40μg/ml为梯度递增），每支试管测量三次取平均值。

由此得到的五个数据能减少标准曲线图的误差。

⑦因Lowry反应的显色随时间不断加深，如果没有严格控制时间，就会对最后吸光度值得测量产生误差。

因此各项操作必须精确控制时间。

⑧部分物质会对双缩脲反应造成干扰作用，如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵等在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂。

若所测样品中尿素、硫酸钠、硝酸钠等物质含量较高，需做校正曲线。

若所测样品中含硫酸铵，需增加碳酸钠-氢氧化钠浓度。

若所测样品酸度较高，需提高碳酸钠-氢氧化钠浓度1~2倍，即可纠正显色后色浅的弊病。