DNA条形码

DNA条形码技术研究进展

摘要：

DNA条形码（DNA barcoding）是近几年国际生物学研究的重点，即通过使用短标准核酸片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定。该技术在动物研究中采用线粒体COI基因中650bp片段，在植物中条形码主要在叶绿体基因组上进行选择，此外还有核基因ITS等。虽然DNA条形码研究还处于起步阶段，面临巨大的挑战，但是越来越多的研究表明DNA条形码可以广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术。本文简略的概述了DNA条形码的主要研究方法，开发应用以及面对的困难和争议，并展望该技术在生命科学领域的发展前景。

关键词：DNA条形码，物种鉴定，分类

引言

科学准确的鉴别区分物种是进一步开展深入研究的和利用的前提和基础。自瑞典植物学分类家Carolus Linnaeus建立双名法命名体系以来，虽然已经鉴定出大约一百七十万种生物，但是地球生物种类繁多，已鉴定分类的物种斤占生物总数约15%，人类仍然没有认识鉴定的物种占大多数，尤其是深海，原始丛林中的物种。

传统生物分类法主要依据形态学特征，比较解剖学等，在形态特征显著的脊椎动物，高等植物，昆虫等生物类群中应用效果较好，对形态差异较小的微小生物则差强人意，此外许多生物的形态容易受环境及生理时期影响，会导致分类产生误差。

自上世纪五十年代DNA双螺旋结构提出以来，人类对遗传物质的认识与日俱增，特别是PCR技术、测序技术和生物信息学技术的飞速发展，推动了利用DNA 蕴藏的信息对系统发育学的快速发展，并应用至生物分类学研究。

条形码技术是现代零售业发展的需求而产生的，在零售业的商品管理与销售中发挥了无法替代的关键作用。生物分类学家从中得到启示，DNA分子一级结构上的线性核苷酸序列可以建立类似的生物条形码，应用于快速鉴别生物。基于此，加拿大Guelph大学教授Hebert等（2003a）首次提出DNA条形码（DNA barcoding）

概念：利用足够变异且容易扩增的相对相对较短的标准DNA片段，在种内的特异性和种间的多样性中建立的一种新的生物身份识别系统从而实现对物种进行快速、准确的识别和鉴定。

1. DNA条形码的筛选开发

1.1 DNA条形码标准

理想的DNA条形码应该符合以下几个标准：（1）序列变异水平适宜，可以将不同各种区分开来，同时种内变异较小。（2）变异区域两端序列高度保守，可以设计众多物种稳定扩增的通用引物。（3）扩增序列尽量短，便于DNA提取和一个反应可以完成测序，尤其是对存在DNA降解的材料（如：腊叶标本，民间药材）。

细胞核内基因含量丰富，但其变化速率较低，过于保守。而线粒体基因组插入删除很少，基于长度差异的考虑，900bp最适合现有技术要求与条件，线粒体13个蛋白编码基因中仅有COI、Cytb（细胞色素b）、ND4、ND5满足上述条件。ND4、ND5进化太快，不能设计通用引物。COI和Cytb都拥有适合的长度和慢的进化速率。Hebert等最终选定了COI，因为COI 在能够保证足够变异的同时容易被通用引物扩增，自身DNA序列很少存在缺失和插入，COI的序列变化上又比Cytb慢，拥有系统发育信号多，所以适合解析亲缘关系密切的分类类群。同时，它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异。依据每百年2%的进化速率，一个有100万年生殖隔离历史的物种类群，650 bp的DNA序列约有12个特征信号位点可用于识别。即使在亲缘关系很近的类群中，大多数物种的进化历史都超过100万年，所以COI基因650 bp的DNA片段足够分析绝大多数的动物物种。据此，已有研究表明COI基因是许多鱼类、昆虫和鸟类等动物分类与鉴别的理想DNA条码。

对于植物而言线粒体COI基因进化速率慢，遗传分化小，不宜用作条形码。因此植物中最可能的条形码是从叶绿体基因组中选择的。虽然叶绿体基因组相对保守，但仍然包含许多变异区域，同时叶绿体基因组相对保守有其自身优势：单亲遗传避免基因重组；植物中均有大量叶绿体，即使DNA高度降解也容易扩增。生物条形码联盟（CBOL）最初建议的植物条形码均为叶绿体片段：matK，ropC1，ropB，accD，nhdJ和YCF5。但因为后三个片段在一些主要植物类群中有缺失，如YCF5在苔藓类植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松属植物中缺失，

因此它们在第二阶段的更新中已被排除。此外核基因组的核糖体DNA ITS片段广泛分布于可以进行光合作用的真核生物（除蕨类植物外）和真菌中，是系统学研究中最常用的片段之一，在GenBank中也积累了大量的数据，但仍有下列原因导致ITS在一些类群中不适合作植物条形码：(1)其长度变异大，多数物种扩增片段长度超过1100 bp，需要使用中间引物才能扩增获得整个基因；(2)存在长的poly-G、poly-C和poly-A，导致测序和序列分析困难；(3)核基因本身存在多拷贝的特性，在种内序列变异较大，进一步降低了该片段作为条形码的应用性。1.2 DNA条形码的开发程序

DNA条形码开发包括如下几个基本过程：（1）材料的采集和DNA提取。样品要具有代表性，覆盖尽可能多的地理群体；（2）设计与合成扩增引物。引物要具有通用性和特异性，在目标类群中容易扩增，条带单一，并且产物大小适宜，一般不要超过700bp；（3）PCR扩增。引物筛选，优化反应条件；（4）直接进行DNA测序或链接载体克隆后测序；（5）序列加工。根据测序峰图比对序列，进行必要的人工校正，去掉载体和不可靠的核苷酸；（6）序列分析。采用MEGA或PAUP等软件计算比较不同分类阶元上的遗传距离，构建Neigh-bour-joining tree（NJ树）等分支图，数据很多时进行多元尺度分析，更直观的用图展示鉴定效果；（7）提交结果。

目前BOLD是仅有动物条形码数据库，提交该数据库的内容主要包括；(1)所需材料的物种名称；(2)标本的目录号与馆藏号等信息；(3)采集人、采集日期、纬度与海拔高度GPS定位参数等标本采集信息；(4)至少500bp的DNA条形码序列；

(5)标本鉴定人；(6)PCR 扩增引物；(7)测序的原始峰图。如果还提供标本的照片以及标本采集生境的描述等信息则更好。

2. DNA条形码的应用

2.1 DNA条形码的优点

生物的代表性表型特征具有一定的可塑性，而且许多生物的形态特征有一定的生长发育阶段性，仅仅依据形态特征进行传统物种分类时可能出错，而且，形态学方法无法鉴定隐存种。不仅如此，分类学家识别能力有限，能准确鉴定超过1000种生物的分类学家凤毛麟角，而传统分类学很难得到项目资助的现实使从事分类学研究的学者愈来愈少，大大制约了分类学和相关学科的发展。与传统的形