PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

10x Buffer
50 μ L
MgCl2 dNTP mixture 上游引物 ( 引物 I) 下游引物 ( 引物 II) 模板 DNA ddH2O
50 μ L 20μ L 25μ L 25 μ L 25 μ L 290μ L
原有的 Taq DNA 聚合酶有 15ul ，此时混合液体系共计 500ul, 此步骤由第一、 二组同学 合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）
温度控制
引物
一小段单链 DNA或
为 DNA聚合酶提供 引物 I 引物 II
RNA
合成的 3’端起点
此外，试验中用到的还有 Mgcl2， Mg2+能激活酶的活性； 10* Buffer 酶提供合适的 PH条件。
缓冲液，为 Taq
2、 PCR反应条件
PCR利用了 DNA的热变性原理， 通过控制温度来控制双链的解聚与结合， 仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。
（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于
水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入
1x 电泳缓冲液，以
没过胶面 2 mm为宜。
（5）将 80ul 的 6xLoading Buffer 加入到 80ul 的核酸荧光染料中，按 1:1 比例混合。
（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取
(3) 共分 25 组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取
20ul 的上述混合液
于的离心管中，加入 15ul 的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。
(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到
PCR仪上进行 DNA扩增。
2、琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。
（8）取出凝胶块，在 DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。 3、紫外分光光度计检测 DNA含量 （1）最后 1 组取 2ulPCR 反应液，加入 98ul 蒸馏水，将样品稀释 50 倍。 （2）以蒸馏水作为空白对照，在波长 260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 （3）加入 DNA稀释液 100ul 至比色杯中，测定 260nm处的光吸收值。 （4）根据下面的公式计算 DNA含量：
（2）配制浓度为 1%（ 1 g/100 mL ）的琼脂糖凝胶 2 块。在锥形瓶中，称取 1g 的琼脂 糖粉，加入 100ml 1x 电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化， 然后冷却至 60 ℃，倒入电泳槽中（每块胶 50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用 透明胶带将两端封住再进行倒胶）
现在使用的 PCR
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。
(!) 变性（模板 DNA解旋）
模板 DNA经加热至 90℃以上。一定时间后，使模板 于它与引物结合，为下轮反应作准备。
DNA双链解离，使成为单链，以便
(2) 复性（退火）
模板 DNA经加热变性成单链后，温度降到 配对结合。
相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的
DNA。在有 DNAmarker （不同已知碱基
对大小的 DNA片段的混合物） 的条件下， 由于不同碱基大小的 DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动
的速度不同， 因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。 通过将扩增出的 DNA片段与已知的
条带做比较， 可以大概推测出该片段的碱基对的大小。 如果要进一步检测其大小， 可以换另
50℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列
(3) 延伸
DNA模板－引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，
按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的
DNA链。
以母链为模板，Leabharlann Baidu
循环数
变性
复性
延伸
第一次（预变
94° C，
－
－
性）
30s
30 次
94 ℃， 20s
52℃， 20s
DNA的解旋和聚
1、 PCR反应组分
条件
细胞内 DNA复制条件分析：
参与的组分
在 DNA复制中
实验条件 / 材
的作用
料
模板
DNA的两条单链
提供复制的模 板
模板 DNA
原料
四种脱氧核苷酸
合成 DNA子链 的原料
dNTP mixture
催化合成 DNA
Taq DNA 聚合
酶
DNA聚合酶
子链
酶
酶
解旋酶
打开 DNA双链
80V，大大
DNA含量（ ul/ml ） =50* （ 260nm的读数） x 稀释倍数
五、注意事项
1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达
16000r/min ，如果这时打
开离心机上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再
打开上盖取出离心管。另外，离心管一定要对称放置。
2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到 超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。
外规格的 DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与 DNA嵌合，一起电泳， DNA图谱观察
仪可以激发特定的蓝色光源， 荧光染料在该光照射下可见到荧光， 荧光的亮度与 DNA大小成
正比。
三、实验仪器及试剂
7 种 PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度 计 250ml 锥形瓶 ( 封口膜 ) 记号笔 卫生纸
72℃，20s
最后一次（保 温）
72℃，30s
3、 PCR产物的检测
(1) 紫外分光光度计
DNA在 260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰， 可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出 DNA的含量。
(2) 琼脂糖凝胶电泳
DNA在电厂作用下， 可以由电源的负极向正极泳动， 泳动的速度与 DNA片段的长度成负
多聚酶链式反应（ PCR）扩增 DNA片段及 琼脂糖凝胶电泳产物检测
一、实验目的：
1、了解 PCR技术的基本操作 2、理解 PCR的原理 3、讨论 PCR的应用
二、实验原理：
PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增
DNA片段的技术，这一技术需要模板、
四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行
四、实验步骤
1、 DNA体外扩增
(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（ 4000r/min,1min ），使管壁没有残留药品，在引物 I 和引物 II 的离心管内用移液器各加入 40ul 双蒸水（ ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所 有的离心管都摆到双面板上。
(2) 向装有 Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分：
20ul 样品于另一的离心管
中，注意不要吸到液体石蜡，再加 1ul 的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取
10ul
缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口， 以防止样液被缓冲液冲散，此外， 为防止手抖将凝胶破
坏，可以用左手扶住右手的手腕。
（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为 80 V ，电流最大。
（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。