绿色荧光蛋白与生

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不 需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用 的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法 比拟的。
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定
②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
⑧灵敏度高
何为生物标记？

生物标记 (Biomarker)是指位于生物体中，被认为有 意义的生化分子。通常是特殊的蛋白质或是特征。 不同种类的细胞具有特定的生化分子，可以借由病 理或是免疫染色的方式展现出来。因而可以辨识出 是哪一种细胞或是组织等。
GFP在动物学研究中的应用

GFP作为新型报告基因用于转基因研究
GFP的发光机制
GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP 之间发生了能量转移。水母素在钙离子的刺激下发 光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是 物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在 生物中的发现。
475nm
504nm
绿色荧光蛋白的发光机制 水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP发出绿光， 水母发光蛋白 脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光 绿色荧光蛋白 绿光
随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发 出的绿光就可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到 一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。
“艺术”中的GFP调色板
a.线粒体；b.肌动蛋白；c.微管蛋白 d.高尔基体；eห้องสมุดไป่ตู้纽蛋白；f.组蛋白
图片欣赏
发绿光的油菜
钱永健实验室
这些位于大脑皮层的神经 元就是通常所说的大脑灰质， 参与思考和各种感觉。
GFP的结构解析
The green fluorescent protein GFP consists of 238 amino acids, linked together in a long chain. This chain folds up into the shape of a beer can. Inside the beer can
GFP的特点

在离体状态下GFP对高温(70OC)、碱性、除垢剂、盐、 有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶除外)有较强抗性 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗 体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分 析。 但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因 此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
structure the amino acids 65, 66
and 67 form the chemical group that absorbs UV and blue light,
绿色荧光蛋白的罐形结构
and fluoresces green.
GFP的结构解析
The dimer contact region. The two polypeptide chains associate over a broad area, with a small hydrophobic patch (in the yellow box) and numerous hydrophilic contacts. The two-fold symmetry axis is in the plane of the page, and is marked by the red arrow. The polar residues are marked with red atoms for oxygen and blue for nitrogen.
GFP微生物传感器
将报告基因转入污染物代谢基因的启 动子中可设计出生物传感器,当特定的污染 物存在时即启动。Ikleo等分别以GFP 和 Ps 作为报告基因和启动子，转入E. coli 重组子中，用以检测水体中微量的苯衍生 物。Roberto 等以GFP 作为报告基因，设 计出可检测环境中亚微克级含量的砷和砷 酸盐的生物传感器。
GFP的结构解析
GFP 晶体结构显示 , 蛋白 质中央是一个罐形结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成 , 荧光基团的形成就
是从这个螺旋开始的 , 罐的顶
部由 3 个短的垂直片段覆盖 , 底部由一个短的垂直片段覆 盖 , 对荧光活性很重要的生色 团则位于大空腔内。
绿色荧光蛋白
Green fluorescent protein(GFP)
从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。 分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第 65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团， 是主要发光的位置。其发光团的形成不具物 种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何 辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基 因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的 生理无影响，是常用的报道基因。
GFP在植物研究中的应用

作为报告基因用于转基因植物研究
GFP作为新型报告基因用于植物的遗传转化， 可以替代与筛选有关的抗生素或抗除草剂标记基因， 既优化植物遗传转化过程，又使转基因植物更安全。

用于植物基因表达调控研究
基因的表达可进行活体检测，利用GFP基因可 以很方便地研究基因表达的时空性。Aspuria等(2002) 将GFP与受生长素诱导的启动子重组后导入植物，用 生长素诱导后，通过观察侧根的分生组织中是否有 GFP的积累来证明生长素的时空表达。
GFP的生色团 GFP的生色团位于64-69的六肽内，确切的说是65-67残基（野生型 中是Ser-Try-Gly)生成的4-(对-羟基苯亚甲基）咪唑-5-啉酮。下 图为生色团形成机制。
绿色荧光蛋白的结构解析
GFP的结构解析

GFP折叠的布局
A topology diagram of the folding pattern in GFP. The -sheet strands are shown in light green, a-helices in blue, and connecting loops in yellow. The positions in the sequence that begin and end each major secondary structure element are also given. The anti-parallel strands (except for the interactions between strands 1 and 6) make a tightly formed barrel.

GFP作为一种新型免疫标记物
利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而 可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵 敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现 了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中 高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合 蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。
下村修成为首位从水母中分离出GFP，并 发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色的科 学家，他被誉为生物发光研究的第一人
马丁· 沙尔菲


如果说下村修是绿色荧光蛋白的“接生婆”，沙尔菲则是绿 色荧光蛋白的价值发现者。 马丁· 沙尔菲等对实现GFP的基因表达做出了突出的贡献 他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光 的遗传标签的作用。
钱永健 美国细胞生物学家。美国国家科学院院士，美国 国家医学院院士，美国艺术与科学院院士。圣地牙哥加 利福尼亚大学生物化学及化学系教授。他让科学界更全 面地理解GFP的发光机理，对GFP坐了改造，通过改变 其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色（蓝色、 蓝绿色、黄色）光的荧光蛋白，为同时追踪多种生物细 胞变化的研究奠定了基础。
GFP的发现
1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管水 母（Aequorea victorian）中分离生物发光蛋 白质——水母素（aequorin）时，意外地得 到了一个副产物。它在阳光下呈绿色，钨丝 灯光下呈黄色，紫外光下呈亮绿色。之后， 他们仔细研究了其发光特性，并发现：是水 中的钙离子增强了水母素的发光。于1963年， 他们在美国《科学》杂志上报道了钙离子和 水母素发光的关系，并于1974年得到了这种 蛋白质。
GFP在微生物研究中的应用

GFP用于微生物与宿主相互作用研究
利用GFP 标记基因可以研究病毒、细菌和真 菌等侵染植物的过程和机制。Bowyer 等在小麦病 原菌中构建了含异柠檬酸酶启动子的GFP 基因，监 测到T. yall undae 侵染小麦时的碳代谢过程。

GFP用于检测环境微生物的迁移
Leff 等将GFP克隆到基因工程菌中,监测其 在水环境中的存活和去向。Scott 等以GFP 红移突 变体作为标记基因,有效地追踪了乳酸细菌在复杂厌 氧系统中的运移。
此细胞图像正在向小脑传送 信息，告诉它肌肉要怎么做
谢谢！
绿色荧光蛋白与生物标记
绿色荧光蛋白的发现史
绿色荧光蛋白的发光机制 绿色荧光蛋白的结构 绿色荧光蛋白的特点 绿色荧光蛋白的应用 主讲人：黄玲 PPT制作：钟鸣 刘伟
水晶水母 3位诺贝尔奖得主第一次分离出的荧光基 因，就是从上面照片中的这种水晶水母体 内获得的。
绿荧光水母——通过体内绿色荧光蛋白发光
作为报告基因构建基因工程载体。以GFPS65T基因 作为筛选标记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性 重组子，替代Lacz蓝白斑筛选，不需X一gal。

GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互 作用
Hale C.A.等利用 GFP标记，研究了可溶性微管蛋 白FtsZ与其内膜受体ZipA间的相互作用，发现，ZipAGFP融合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于FtsZ与 膜相关的特殊环中。
GFP在生物医学中的应用

药物筛选
利用GFP荧光探针，从数量众多的化合物中 判断出那些化合物具有与信号分子相似的，能引起 配体-受体复合物迁移并介导生理反应的功能。如介 导糖皮质激素受体（hGR)迁移药物的筛选模型的成 功构建。

用于临床检验 示踪病原菌

GFP在肿瘤研究中的应用
科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动
GFP折叠的布局，从C-末端除去多于7个的氨基酸 或者从N-末端除去带蛋氨酸的片段就没有荧光了， 没荧光的变异就不会表现出整个发色团的吸收光谱 特征。最后的7个残基无序，在圆筒的外边弯回来， 不构成筒的外壁，它们的存在不是必需的，另外在 加一些残基也没关系。至于N-末端，在圆筒内的 第一条蛋白链开始于残基10，筒的形成不需要N末端部分。 N-末端片段是在蛋白一头的帽子的主 要成分，是折叠的，可以保护发色团。在N-末端 延伸不会破坏蛋白的结构。
用于植物信号转导研究
GFP结合荧光共振能量转移(FREP)为研究植 物信号转导也提供了新方法。例如： Allen等用 YEP-GFP-Ca2+ 传感器检测拟南芥保卫细胞内Ca2+ 浓度的变化，结果表明，外源的Ca2+ 和 ABA都能 引起保卫细胞内Ca2+浓度的变化。这和过去用荧光 染色法观察到的结果一致。