绿色荧光蛋白与生

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实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。

2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。

3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。

二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。

本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。

再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。

将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用近几十年来，绿色荧光蛋白（GFP）被广泛用于生物学的研究，特别是在细胞生物学领域，它在基因表达分析、膜蛋白研究，以及定位和追踪细胞外状态变化等方面提供了有力的工具。

绿色荧光蛋白最初是从拟南芥中分离出来的，它是一种可以在生物细胞中发出可见的绿光的蛋白质。

GFP可以与其他蛋白质结合在一起，可以用来检测特定蛋白质的表达和定位。

利用绿色荧光蛋白的特性，我们可以实现转基因技术的可视化，同时实现基因的定位，这使得细胞的动态变化以及基因调控可以被直观定量地观察出来。

在GFP的研究过程中，科学家发现GFP本身也有可以改进的特性，不仅可以让它发出绿色的光，也可以被用来实现转基因技术的可视化。

它的发光强度与温度变化和环境改变有关，当温度提升或温度较高时，GFP的发光强度会增强。

GFP还可以用来检测特定的一种或多种蛋白质，能够实现精确的蛋白质定位。

同时，研究人员还发现GFP的表达能力可以被亚细胞定位，发现细胞内部基因表达的动态变化。

GFP也被用于膜蛋白研究，可以很好地实现膜蛋白在细胞表面的定位，从而有助于我们更好地分析膜结构和功能，为细胞生物学研究带来新的视角。

此外，GFP还可以被用于探索和分析细胞外状态变化，它能够通过显示细胞的迁移、聚类、分离等状态变化来揭示细胞的行为和表型特征，成功地帮助了许多细胞生物学研究。

绿色荧光蛋白是一种重要的细胞生物学研究工具，它的出现使得细胞的研究变得更加容易，提高了生物学研究的效率。

它不仅可以被用于基因表达分析和定位，也可以用于膜蛋白研究，使我们更好地了解细胞的行为和表型特征，实现细胞外状态变化的追踪，进而发现基因调控的模式，目前，GFP的技术已经成为细胞生物学研究技术的重要组成部分，将为未来更多的细胞生物学研究带来更多的帮助。

综上所述，GFP在细胞生物学研究中具有重要的意义，它提供了一种强大的分析工具，可以实现基因表达分析、膜蛋白研究和细胞外状态变化的定量观察。

绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用

收稿日期：００－５２１－２２．１基金项目：西省科技攻关项目（Ｊｆ１５）山西省自然科学基金项目山２ｆ）０６；【）３７国家自然科学基金项目（７１８省归国留学人员资助项目。３７５１０
２ＧＦＰ的应用特点
２世纪，Ｆ为一种新的报告基因Ｔ具得到了迅速发展，１ＧＰ作
与其他报告基因相比，Ｆ具有许多显著的特点：）ＧＰ（无需损伤细１
ｌＧＰ的结构和荧光性质Ｆ
胞即可研究细胞内事件，且无毒作用（肿属不依耪胜，；２在原核、
利用ＤＡ重组技，目的基因与ＧＰ基因构成融合基因，Ｎ将Ｆ转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于ＧＰ分子量小，Ｆ在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，应用得最多和最成功的是ＧＰ与宿主蛋白构Ｆ
蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。利用ＧＰ的Ｆ
蛋白标示不同的蛋白质和细胞。由此，下村修、马丁一查尔菲和加底物或辅助因子等协助指示；）（易于构建载体，８可进行活细胞钱永健获得了２０年度诺贝尔化学奖［０８２１。
ＧＰ属于五大类报告基因之～，是虚用最多的发光蛋白。ＦＧＰ用３５ｎ的紫外光和４５ｎ的蓝光激发，在５８ｍ处Ｆ９ｌｎ７ｌｎ可０ｎ自行发出绿色荧光。之所以能够发光，因其氨基酸序列中第它是

绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过
自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定, 不易变性,
用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是
当pH 值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP 的生色团之间是通过共价键结
合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在
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3 广谱性
首先表现在它的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次就是没有细胞种类和位置的限制，在各个部位都可以表达，发出荧光。
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4 易于载体构建
由于GFP 较小，只含有238 个氨基酸，编码GFP 的基因序列也较短，约2.6kb，所
1 对细胞生理过程的监控在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突
变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目前GFP融合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。 Shen[10]等在培养的神经元中发现，细胞内的Ca2+瞬间变化就会引起GFP标记的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaM KⅡ)可逆地易位到突触后膜的 densities上。Shi[11]等用GFP标记来监控α-氨基羟甲基恶唑丙酸 (AMPA)的受体，发现它会从细胞内膜转移到树突棘的表面，根据突触中AMPA受体的含量可以解释突触沉默、活化的原因和机制。 Siegel[12〕等将野生型的GFP插人Shake K十通道的特殊部位，形成一个异源嵌合体，这个嵌合体发出的荧光将会随着细胞的去极化作用而缓慢的减少。相反，Yanagawa[13]等将β-内酰胺酶插人GFP得到了一个融合体，当此融合体与β-内酰胺酶抑制肽(BLIP)结合时,它的荧光发射量会大大增加。

绿色荧光蛋白

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的分子生物学及其应用
绿色荧光蛋白的研究史
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
பைடு நூலகம்
GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。
绿色荧光蛋白的研究史
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用

绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是一种由蛋白质基因编码的荧光标记物，可以在活细胞中可视化蛋白质的位置和移动。

GFP最初是从海葵中发现的，现在已被广泛应用于生物学研究中。

在细胞生物学中，GFP已成为一种重要的工具，用于研究细胞的结构、功能和信号转导。

GFP可以用于标记蛋白质，从而观察它们在细胞中的位置和运动。

通过将GFP基因与目标蛋白质基因融合，可以制造出发出绿色荧光的融合蛋白。

这种荧光标记可以在活细胞中使用显微镜观察。

因为GFP 是自发发光的，所以不需要其他化学试剂或光源，也不会伤害细胞。

此外，GFP的亚细胞定位可以通过不同的融合蛋白实现，比如细胞核、质膜、内质网、线粒体等。

除了用于观察蛋白质的位置和移动，GFP还可以被用于研究细胞的功能和信号转导。

例如，GFP可以用于标记细胞器，如细胞核、线粒体和内质网，从而研究它们的功能和相互作用。

此外，GFP还可以用于标记细胞信号分子，如钙离子和蛋白激酶，从而研究它们在信号传递中的作用。

总之，GFP已成为一个重要的工具，在细胞生物学研究中发挥着重要作用。

通过使用GFP融合蛋白标记，可以可视化细胞内蛋白质的位置和运动，研究细胞的功能和信号转导，以及研究细胞亚结构。

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绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用教材

4 用于细胞内蛋白质的动力学研究

研究细胞内蛋白质相互作用的技术主要有两种：光漂白荧光恢复法 (FRAP)、光漂白荧光损失法(FLIP)。FRAP主要是通过对细胞内特定的点或区域进行强烈的光照，使荧光发生光漂白作用，再通过相同时间间隔的光影像采样记录下荧光恢复的动力学过程。FRAP不仅可以确定细胞器上的蛋白，还可以确定流动蛋白的滞留时间。转录、mRNA前体的剪切、DNA的修复中蛋白质复合体操作机制都可以用这种方法来研究。FLIP是对细胞的一个区域进行持续性的光漂白，再对光漂白区外的荧光的损失进行监控就可以获得一些标记蛋白之间的相关性信息。目前正在体外通过改变光照点的大小和固定细胞来研究光漂白作用的可逆性，不过还是与活细胞的环境有一定的差距。另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数[19]。
5 计算细胞生长速度

在高水平组合型表达GFP 的细胞品系中, 在细胞生长的对数期, 绿色荧光蛋白所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度都可以相应地转变成细胞浓度。尽管在细胞生长的后期, 用荧光信号计算得到的细胞数目略低于培养物中的实际数目。但在常用的台盼蓝计数方法中, 这个误差是允许的。利用这一技术, 可以测定某些细胞的分布和生长状况, 尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究, 取得了不错的效果。
一、GFP的结构

绿色荧光蛋白生色团形成过程

绿色荧光蛋白生色团形成过程嘿，朋友们！今天咱来聊聊绿色荧光蛋白生色团形成的这个神奇过程呀！你说这绿色荧光蛋白就像一个小小的魔法盒，里面藏着让人惊叹的秘密呢。

这生色团的形成啊，就好比是一场奇妙的化学反应大冒险。

想象一下，各种分子就像一群小伙伴，它们在特定的条件下相遇啦。

它们相互作用、相互拥抱，一点一点地构建出那个独特的生色团。

这过程多有意思呀！先来说说那些关键的分子们，它们就像是这场冒险中的主角。

它们在细胞这个大舞台上，按照特定的剧本开始表演。

它们的相遇不是偶然，而是经过了精心的安排。

然后呢，随着反应的进行，生色团开始慢慢显现出来。

就好像是从混沌中逐渐绽放出一朵奇异的花，散发着独特的光芒。

这光芒可不简单，它能让我们看到那些原本隐藏在微观世界里的奇妙景象。

你知道吗，这绿色荧光蛋白生色团的形成对于科学研究来说，那可真是太重要啦！科学家们可以利用它来追踪细胞内的各种活动，就像是给细胞装上了一个小小的定位器。

这多厉害呀！没有它，我们对细胞的了解可就要大打折扣了呢。

而且呀，这生色团的稳定性也很关键呢。

要是它不稳定，一会儿亮一会儿不亮，那可就麻烦啦。

就好比是一盏灯，总是忽闪忽闪的，那可怎么照亮我们探索的道路呢？在这个过程中，每一个环节都不能出错。

一旦有一点点偏差，可能就得不到那美丽的绿色荧光啦。

这就好像搭积木，一块没放好，整个城堡可能就垮啦。

哎呀，想想都觉得神奇！从那么多分子中，居然能形成这么独特的生色团。

这难道不是大自然的杰作吗？这就像是一个伟大的艺术家，精心雕琢出了一件无与伦比的艺术品。

总之呢，绿色荧光蛋白生色团的形成是一个充满魅力和神奇的过程。

它让我们看到了微观世界的精彩，也为科学研究打开了一扇又一扇的大门。

我们应该好好珍惜这个神奇的发现，让它为我们带来更多的惊喜和收获呀！这就是我对绿色荧光蛋白生色团形成过程的理解，你们觉得呢？原创不易，请尊重原创，谢谢!。

绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展

绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。

GFP具有自发的荧光特性，能够发出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。

GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。

在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。

一、GFP的发现与基本原理1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。

1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用前景。

GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的参与。

GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。

GFP的发光特性具有“自发、可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研究中广泛使用的荧光标记分子。

二、GFP在光遗传学的应用光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时监测的技术。

GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶和离子泵的表达。

通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。

GFP的分子可以通过基因克隆技术导入到目标细胞或组织中，与其他光敏感蛋白一起被利用为光敏受体。

结合光学影像技术，研究人员可以通过光刺激来操作蛋白质的表达、离子流动、膜的通透性等，从而研究细胞和生物体系中各种生理或病理情况的变化。

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用

分子植物育种，２００５年，第３卷，第２期，第２４０－２４４页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．２，２４０－２４４
专题介绍ＲＥＶＩＥＷ
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用
吴瑞张树珍＊
中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口，５７１１０１＊通讯作者，ｚｈａｎｇｓｚ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｈｋ．ｈｉ．ｃｎ
１．２ＧＦＰ的改进
由于野生型ＧＦＰ折叠受温度影响，发光较弱；其次， -./ 基因在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达（ＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＡｍｏｓ，１９９５）。因此人们运用定点突变、ＤＮＡ－ｓｈｕｆ－ｆｌｉｎｇ等技术对野生型ＧＦＰ进行改造。
１ＧＦＰ的基础研究
绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用２４１ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
１．１ＧＦＰ性质
从多管水母 !"#$%&’( )’*+%&’, 中分离出的ＧＦＰ是由２３８个氨基酸残基组成的单体蛋白，呈酸性，是一种球状蛋白，分子量为２７￣３０ｋＤ。其中央是一个 ! 罐（"－ｃａｎ）结构（Ｏｒｍｏｅｔａｌ．，１９９６）。ＧＦＰ生色团ＧＦＰ的生色团位于是其发出荧光的物质基础，６４￣６９的六肽内。生色团在翻译后２￣４ｈ内自动催化形成，而ＧＦＰ在合成后需经过一定的折叠过程形成正确的构象后才有功能。ＧＦＰ生色团的形成需要Ｏ２，并使６６位氨基酸残基的 #、 $ 键间脱氢。因此，厌氧条件下ＧＦＰ不能形成荧光。ＧＦＰ在４５０￣４９０ｎｍ蓝光下最稳定，在３４０￣３９０ｎｍ或３９５￣４４０ｎｍ的范围内，会发生光漂白现象；强还原剂如５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＳＯ４或２ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４能使ＧＦＰ转变为非荧光形式，但重新暴露在空气中时，ＧＦＰ荧光便会立即恢复；弱还原剂和中度氧化剂对ＧＦＰ荧光影响不大；在离体状态下，ＧＦＰ对高温（７０! ）、碱、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶有较强抗性（Ｗａｒｄａｎｄ在Ｂｏｋｍａｎ，１９８２）。ＧＦＰ荧光在ｐＨ７．０￣１２．０时稳定，ｐＨ５．５￣７．０时开始受到影响（ＢｏｋｍａｎａｎｄＷａｒｄ，在高温（＞７０" ）、极端ｐＨ或胍基氯化物条件１９８１）；下，ＧＦＰ会发生变性，而使荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复（ＷａｒｄａｎｄＢｏｋｍａｎ，目前对ＧＦＰ的荧光发光机制还不清楚，人们１９８２）。推测其生色团的形成必须经过氧化脱氢步骤，并且不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异（Ｈｅｉｍｅｔａｌ．，１９９４）。ＧＦＰ有２个次峰在４７５ｎｍ；有一个发射吸收峰，主峰在３９５ｎｍ，峰在５０８ｎｍ。ＧＦＰ的生色团至少由２种不同的化学组分组成，即中性酚和阴离子酚。４７５ｎｍ峰随ＧＦＰ分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而增加，３９５ｎｍ则随着ＧＦＰ分子生色团的质子化或中性生色团的增加而增加。野生型ＧＦＰ在室温或低于ＧＦＰ几乎都能正确而快速地折叠，室温下表达时，但当高于室温时，折叠速度剧烈下降（汪恒英等，２００４，生物技术，１４（３）：７０－７２）。

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

０Ｏ）．１。④ 脏器系数：８周龄，２周龄的ＧＰ小鼠，胸腺的脏器系数明显低于对照组，异具有显著性（６— ９—１Ｆ其差Ｐ
＜．１；００）９—１龄，３～１２周１４周龄的ＧＰ小鼠，肝脏的脏器系数明显高于对照组，异具有显著性（０Ｏ）Ｆ其差Ｐ＜．１。 ⑤ 病理检测：８周龄有部分ＧＰ小鼠胸腺发育不良，他受检脏器和其他年龄段动物未见明显病理改变。结论６— Ｆ其
异具有显著性（＜．１；５周龄的ＧＰ小鼠，摄食量明显高于对照组，异具有显著性（＜．１。 ② 血常Ｐ００）４～Ｆ其差Ｐ０Ｏ）规测定：８周龄，２周龄的ＧＰ小鼠，红细胞计数（Ｂ）６— ９—１Ｆ其ＲＣ明显低于对照组，异具有显著性（＜．１；差Ｐ００）９
Ｈｉｏｙ，Ｈｕ，ＵＹｎｆｎ，ＱＮ－ｈｏＡ — ｏｇＥＸａ —ｕＥＪｎＸａ — ｇＩＣａ，ＧＯＨｎｅ
（ｎｔｕｅｏａｏａｏｙＡｎｍａｃｅｃ，ＣｉｅｅＡａｅｆＭｅｉａｃｅｃＩｓｉｔｆＬｂｒｔｒｉｌＳｉｎｅｈｎｓｃｄｍｙபைடு நூலகம் ｄｃｌｉｎｅ，ＫｅａｏａｏｔＳｙＬｂｒｔｒｙ
２１年４月０１
中国实验动物学报

绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中的应用

3 GFP的稳定性
GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体, 用放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10µg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP 的消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。

绿色荧光蛋白技术在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白技术在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）技术是一种在细胞生物学研究中广泛应用的技术。

GFP技术利用从海洋放线菌（Aequorea victoria）获得的GFP基因，通过基因工程技术将其导入到目标细胞中，从而实现对目标细胞的可视化和追踪。

GFP技术在细胞生物学研究中的应用非常广泛。

下面将从细胞标记、蛋白质定位和基因表达调控等几个方面来详细介绍。

首先，GFP技术可以用于细胞标记。

通过将GFP基因导入到目标细胞中，可以实现对细胞的可视化标记。

这对于细胞追踪、细胞分化以及研究细胞生命周期等都非常有意义。

例如，在神经科学研究中，研究人员可以将GFP基因导入到神经元中，通过观察GFP的荧光表达来跟踪神经元的生长和连接过程。

另外，GFP技术也可以辅助研究细胞分化。

将GFP基因与特定的分化标记基因组合，可以通过荧光观察该细胞的分化状态。

其次，GFP技术可以用于蛋白质定位研究。

将GFP与目标蛋白质序列相连，可以通过荧光观察该蛋白质在细胞内的定位位置。

这对于研究蛋白质的运输、定位以及功能都非常重要。

例如，在细胞生物学研究中，可以将GFP与细胞质蛋白、核蛋白或细胞器蛋白等相连，通过观察GFP的荧光表达来确定蛋白质在细胞中的位置。

这种定位研究可以帮助我们更好地理解蛋白质的功能。

此外，GFP技术还可以用于基因表达调控研究。

通过将GFP与目标基因的调控序列相连，可以通过观察GFP的荧光表达来研究基因的表达调控机制。

例如，在遗传学研究中，可以将GFP与特定的启动子相连，通过观察GFP的荧光表达来研究该启动子对于基因表达的调控作用。

此外，GFP技术还可以结合其他技术，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光染料和激光共聚焦显微镜等，来进一步提高荧光标记的灵敏度和分辨率。

这些组合应用可以实现对细胞和细胞器更加精确的观察和定位。

总而言之，绿色荧光蛋白技术在细胞生物学研究中具有广泛的应用。

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域融合表达载体的构建

ＫＲ３为模板，ＣＤｎＰＲ扩增ＫＲ３基因，目的片段克隆至ｐＤ８Ｔ载体，Ｄｎ将Ｍ１．其产物双酶切后连接到质粒ｐＧＰＮＥＦ－Ｉ中。
结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，小正确。结论大成功构建了ＥＦＧＰ
果显示，实验组大鼠在第２周和第４周时ＡＴＡＴ．Ｌ、Ｓ
水平明显低于阴性对照组，明经过移植骨髓间充说质干细胞大鼠肝功能得到明显改善，Ａ水平明显ＭＤ
ｄａｄｃ［］ＰｏａｃＵＡ，９５９（１：８７ｉｔｅＪ．ｒｃＮｉＡｉＳ１９，２１）４５．ｅｌ［］Ｓｉｃ，９７２６５０）７．Ｊ．ｃｅｅ１９，７（３９：１ｎ
性对照组的脚、ＳＡＴ和ＭＡ均明显高于空白对照胞所分化的内皮细胞成分，Ｄ改善缺血缺氧，改善肝脏
组，异显著，＜００。第２周时，验组大鼠微环境，促进受损肝脏再灌注损伤的修复。本项差Ｐ．５实可ＡＴＡＴ和ＭＡ与阴性对照组比较，Ｌ、ＳＤ明显低于阴性实验研究对临床缺血再灌注损伤的修复具有重要的
３７．８
修复具有促进作用。
如何减少肝脏再灌注损伤及促进肝脏再灌注损
伤的修复，多年来一直困扰着临床医生。随着人们
对问充质干细胞研究的Байду номын сангаас 渐深入，已经证实间充质

gfp在生物学中的应用

gfp在生物学中的应用
GFP是一种绿色荧光蛋白，具有亮度高、表观稳定、不需加底物等优点，因此被广泛应用于生物学研究中。

以下是几个常见的应用场景：
1. 荧光成像
利用GFP标记蛋白或细胞，可以通过荧光显微镜观察到它们的分布、运动和相互作用，为了解生物过程提供了有力的手段。

例如，可以观察细胞分裂、基因表达、细胞信号转导等过程。

2. 基因转导
通过将GFP作为荧光报告基因，可以实现基因转导的定量检测。

例如，将GFP与感光酶结合，可以检测光线的强度；将GFP与细菌合成的其他蛋白结合，可以检测细菌的生长状态。

3. 病原体检测
利用含GFP的细菌或病毒作为生物传感器，可以实现针对特定病原体的快速检测。

例如，在食品卫生和水质检测中，可以通过检测含GFP的大肠杆菌等细菌的存在来判断是否污染。

总之，GFP在生物学研究中具有广泛的应用前景，已成为生命科学领域不可或缺的工具之一。

绿色荧光蛋白及其在分子生物学上的应用

这一绿色荧光蛋白显示出了其一系列重要而独特的应用价值。对于活体研究而言，从简单基因表达
到基因时空表达的复杂分析。ＦＧＰ比其它发光标
记蛋白（ｈｏｏｅｉＲｐｒｒＰｏｉ）Ｂ半乳糖Ｃｒｍｇｎｅｅｏｔｒｔｎ如ｅｅ苷酶有着更明显的优势。文根据近几年国内外的本
应用，包括蛋白融合，细胞筛选，定位标记，因表达调控，算细胞生长速度等。基计
关键词：ＰＧｅｎｆｏｅｅｔｒｔｎ；子生物学：用ＧＦ（ｒｅｌｒｃｎＰｏｅ）分ｕｓｉ应
中图分类号：６Ｑ３
文献标识码：Ａ
文章编号：６１３９（０８０ — ０６０１７ — ６９２０）４０２ — ４
引言
１６９２年、ｈｍｍｒ【太平洋的发光水母。ｉｏｕａ等１Ｓ］在
（ｅｕｒａｖｏａ中发现了能够释放出生物荧光Ａｑｏｅｉｆ）ｔｉ的绿色荧光蛋白（ｒｅｕｒｓｅｔｒｔｉ，Ｆ。ＧｅｎｆｏｅｃｎｏｅｎＧＰ）ｌＰ
种激发态而发光。这种酶，底物的相互作用是生物．而ＧＰ是第一个例外．的２ｋａ的单体由Ｆ它７Ｄ
发光的普遍模式。
受福尔马林的固定，因而可以制成长期保存的标本；另外对细胞内ＧＰ的检测非常简单，显微镜、Ｆ用

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。

通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。

根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。

它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。

gfp荧光蛋白的n和c端

gfp荧光蛋白的n和c端
在探讨GFP荧光蛋白的N端和C端时，首先需要理解GFP的结构和功能。

GFP，全称为绿色荧光蛋白，是一种蛋白质，由于其独特的荧光性质，被广泛用于生物学研究中，尤其是在荧光显微镜技术中。

其结构包括一个环状结构和一个桶状结构，其中环状结构中的生色团负责发出绿色荧光。

现在来谈谈N端和C端。

在大多数蛋白质中，N端是指向氨基酸序列的起始端，而C端是指向序列的结束端。

对于GFP来说，其N端和C端的功能和特性也是不同的。

1. N端：通常与蛋白质的定位有关。

例如，当目标蛋白与荧光蛋白的N端融合时，该融合蛋白可能会被定位到特定的细胞器。

2. C端：通常与蛋白质的稳定性有关。

某些情况下，C端的特定序列可以增加蛋白质的稳定性，使其在细胞内更持久地表达。

因此，在构建融合蛋白或进行相关研究时，了解目标蛋白的性质以及希望获得的结果是非常重要的。

不同的融合方式可能会影响实验结果，因此在实验设计和实施过程中要特别注意这一点。

生色团名词解释

生色团名词解释
生色团名词解释：是指分子中含有的，能对光辐射产生吸收、具有跃迁的不饱和基团及其相关的化学键。

某些有机化合物分子中存在含有不饱和键的基团，能够在紫外及可见光区域内（200～800nm）产生吸收，且吸收系数较大，这种吸收具有波长选择性，吸收某种波长（颜色）的光，而不吸收另外波长（颜色）的光，从而使物质显现颜色，所以称为生色团，又称发色团。

绿色荧光蛋白的生色团由三个连续的氨基酸所构成，在野生型绿色荧光蛋白中分别是65、66、67位的Ser-Tyr-Gly所构成。

之前的研究一般认为绿色荧光蛋白中荧光基团的形成首先需要多肽链折叠成一个接近天然构象的结构。

折叠完成后，Gly67的氨基氮N67亲核攻击Ser65上的羰基碳C65，环化形成一个不稳定的五元杂环中间体，再经过脱水以及氧化，形成生色团。