鸡蛋中提取胆固醇

试剂和溶液：除另有规定外，使用分析纯试剂，水为GB/T6682推荐使用的一级水

甲醇：色谱纯

无水乙醇

石油醚：沸程30-60℃

无水乙醚

无水硫酸钠

氢氧化钾

60%氢氧化钾溶液：60克氢氧化钾，加水40ML 混合溶解

胆固醇：纯度≥99%

标准贮备液：胆固醇标准品0.05g(精确至0.1mg)，用无水乙醇溶解定容至50mL，溶解每毫升相当于1mg胆固醇，放置4℃密封可贮藏半年

标准工作溶液：分别吸取标准贮备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml，用无水乙醇定容至10ml，配置相当于0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml浓度标准溶液

仪器和设备：

高效液相色谱仪，具有紫外检测器或相当的检测器

分析天平，感量0.1mg

色谱柱，C18反相色谱柱（4.6mm*150mm,5um）

分析步骤

1.样品处理

1.1皂化

称取粉碎均匀的样品0.25-10g（胆固醇含量约为0.5mg-5mg,精确至0.1mg)，于250ml平底烧瓶中，加入30ml无水乙醇，10ml60%氢氧化钾溶液（4.7），混匀，将试样在100℃磁力搅拌加热套皂化回流1h，不时震荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，用5毫升无水乙醇（4.2）自冷凝管顶端冲洗其内部，取下圆底烧瓶，冷却至室温

1.2提取

定量转移全部皂化液于250ml分液漏斗中，用30ml水分2-3次冲洗圆底烧瓶，洗液并入分液漏斗，再用40ml石油醚和乙醚混合液(1+1,体积比）分2-3次冲洗平底烧瓶并入分液漏斗，振摇2min，静置，分层，转移水相于第二个分液漏斗，再用30ml石油醚和乙醚混合液（1+1，体积比）重复提取两次，弃去水相，合并三次有机相，用蒸馏水每次100ml，洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻振摇，防止乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠（4.5）脱水，转移到150ml平底烧瓶中

1.3浓缩

将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解定容至5ml，溶液通过0.45um过滤膜过滤，收集清液于进样瓶中，待色谱仪测定

2.测定

2.1色谱参考条件

色谱柱：C18反相色谱住

柱温：38℃

流动相：甲醇

流速：1ml/min

测定波长：205nm

进样量：10ul

标准曲线检测

分别取10ul标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，检测标准曲线

2.3样品中胆固醇的测定

取10ul样液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰面积），由标准曲线上差得样液中胆固醇的含量，或利用回归方程式计算样液中胆固醇含量

3.结果计算

样品中胆固醇的含量（x）以毫克每百克（mg/100g)表示，按下式计算：

x=（c×V）÷m×100

式中：

x-----样品中胆固醇的含量，单位为毫克每百克（mg/100g)

c-----样液中胆固醇的含量，单位为毫克每毫升（mg/ml)

V-----容体积，单位为毫升（ml)

m----样品质量，单位为克（g)

平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字