第四章 蛋白质与酶的化学修饰
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酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但
酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团， 可能与酶的功能或构象没有明显联系。
影响因素：
1. 改变蛋白质功能基的pKa值；
2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性；
3. 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的 取向；
4. 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体 化学适应性； 5. 试剂的结合。
3. 位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、 辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修 饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能 提供蛋白质表面的有用信息。
4. 催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起 一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。 5. 局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂 的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水 环境能阻止产物中电荷分离的反应。
四、化学修饰的影响因素
有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的
生物学活性(称非必需部分的修饰); 但大多情 况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧 失)。
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：
1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。
一）、蛋白质功能基反应性的影响因素
蛋白质的修饰反应都是亲核反应。被修饰蛋
三）、修饰剂反应性的决定因素
1. 选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的 特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时 可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。
2. 静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引 到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使 修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向 双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制 修饰作用。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：
A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇， 与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至 消除； “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、 抗体结合。
4.3、化学修饰的种类
一．表面修饰 二．内部修饰 三．与辅因子相关的修饰 四．物理修饰
五．亲和修饰
一、表面修饰
1. 化学固定化 2. 小分子修饰 3. 大分子修饰 4. 肽链的交联
1、化学固定化
通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价 连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，
酶的性质也相应发生改变。
苯乙二醛
5）、酚基和羟基（—OH）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、 Tyr
羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同
时修饰羟基、氨基和巯基 Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼 一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性， 能发生亲电取代反应
修饰反应 —— 酚基和酚羟基
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑
基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代：
•
I2＋
+ HI
硝化：
• (NO2)4C
+
+(NO2)3CH
第四章 蛋白质与酶的化学修饰
4.1、概述 4.2、化学修饰的设计 4.3、化学修饰的种类 4.4、修饰酶的性质及特点 4.5、化学修饰的应用
4.6、化学修饰的局限性
4.1、概述
目前为止尽管人类已经发现了数千种酶, 但是真正具有商业价值即每年销售额可超过
wk.baidu.com
1000万美元的酶不过数十种,为什么？
一、限制酶的应用的原因
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小、性状、亚基数等 （3）酶侧链基团的性质及其反应性 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、 胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等
二、修饰剂的要求
1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质 的吸附性
2.小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子 侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主
要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的
侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有： 1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作 用 2、基团之间的障碍（位阻效应）
3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、
旋转自由度等
二）、蛋白质功能基的超反应性
超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂
能发生非常迅速的反应。
5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时： ①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢 键等维持天然构象的平衡力 ②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态 和它们之间的相互结合及作用方式 许多大分子修饰剂本身就是多聚电解 质，能在酶分子表面或微环境区域形成 一 层“缓冲外壳”。
4.2、化学修饰的设计
一、酶性质的了解
例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电 状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电 荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备： 选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性条件下进行； 所标记的残基在肽链中稳定以易于分离 鉴定； 修饰反应的程度能简单测定；
三、反应条件的选择
酶的化学修饰（chemical modification）：
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
四、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后）
酚基亲电取代反应
碘化反应
四硝基甲烷(TNM)
修饰反应 —— （酚）羟基
O-酰基化反应
乙酰化
乙酸酐
电荷消失
芳基化
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)
电荷消失
电荷消失
芳基化
2,4一二硝基氟苯(DNFB) 碘代乙酸(IAA) 醛
烷基化 引入负电荷 还原 烷基化 芳基化 引入正电荷 电荷消失
丹磺酞氯(DNS)
2）、 羧基（—COOH）修饰 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 — COOH，以及肽链的末端羧基
1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
五、酶化学修饰的原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与 酶形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。 2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮 盖”了酶的活性部位。
修饰剂： 2 ， 4 －二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙 酰胺等。
烷基化反应
2) 酰基化反应
试剂特点：
含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（ Ser 、 Thr ），酚 羟基（Tyr）
酰基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子 的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（ Lys ， Arg ），巯基（ Cys ），羧基（ Asp 、
Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
对氯汞苯甲酸(PMB)
2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)
可容许低浓度蛋白质的光 谱定量分析
250 nm处有 最大光吸收
修饰反应 —— 巯基
S-烷基化反应
同时会使氨基乙酰化
碘代乙酸(IAA)
300 nm处 有最大光 吸收
N一乙基马来酰亚胺(NEM)
4） 胍基（—N=C(NH2)2）修饰 胍基存在于酶蛋白的 Arg 残基侧链上
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠
近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适 pH发生偏移。 糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5， 与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖 浆生产工艺。
载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统
Km增加，反之，Km降低。 增加酶分子构象稳定性。
在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起 重要作用
胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般
采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或 弱碱性条件下反应，一般是可逆反应
修饰反应 ——
需在黑暗中进行, 因其可作为光 胍基（与邻二酮的反应） 敏剂破坏Trp\His\Tyr等残基
硼酸盐
丁二酮
硼酸盐 1,2-环己二酮
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量 不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时 酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。 由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些 非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例
2、修饰剂上反应基团的数目及位置 3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件 一般要求较大分子量、良好的生物相容性 和水溶性、分子表面有较多反应活性基团； 试剂的选择—要根据修饰目的选择
例如对氨基修饰可有几种情况——
修饰所有氨基而不修饰其它基团； 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基； 修饰具有催化活性的氨基；
（四硝基甲烷）
特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
氨基修饰（Lys）
羧基修饰（Asp、Glu） 巯基修饰（Cys）
胍基修饰（Arg）
羟基修饰（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修饰（His） 吲哚基修饰（Trp） 甲硫基修饰（Met）
二硫键修饰
亲和修饰
1）、 氨基（—NH2）修饰 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽链末 端氨基 非质子化的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选 择性修饰 一般情况下 -NH2 的 pKa = 10，其解离程度取 决于微环境 氨基的修饰反应主要有N-烷基化等
1、稳定性不够，不能适应大量生产的需 要。 2、作用的最适条件不符。 3、酶的专一性 4、米式常数过大 5、临床应用的特殊要求 6、酶活性不够高
二、改变酶特性有两种主要的方法
1)通过化学修饰的方法来改变已分离出来
的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
三、酶化学修饰的概念
硼氟化三甲洋盐
甲醇
3）、巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的 -SH 巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性 最高的基团 巯基容易被氧化成 —S—S—，在维持蛋白亚基 之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的 修饰产物
修饰反应 —— 巯基
二硫键置换反应
常用于定量测定蛋白质分子-SH 数目、研究-SH的改变程度和SH所处的环境。
5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB) 又称Ellman试剂
TNB 412 nm处
有强吸收
4,4‘-二硫二吡啶（4-PDS） 324 nm处 有吸收
修饰反应 —— 巯基
与含汞有机物的反应（—SH 对 Hg 的亲和力很强）
在水溶液中，—COOH 通常解离成负离子，亲核
性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、 成酰胺反应
修饰反应 —— 羧基
碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）
碳二亚胺
R, R‘为烷基；X为卤素
修饰反应 —— 羧基
酯化反应
胃蛋白酶与[14C]硼氟 化三甲洋盐在pH 5时 酶完全失活，研究表 明两-COOH为该酶必 需基团
酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团， 可能与酶的功能或构象没有明显联系。
影响因素：
1. 改变蛋白质功能基的pKa值；
2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性；
3. 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的 取向；
4. 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体 化学适应性； 5. 试剂的结合。
3. 位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、 辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修 饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能 提供蛋白质表面的有用信息。
4. 催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起 一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。 5. 局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂 的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水 环境能阻止产物中电荷分离的反应。
四、化学修饰的影响因素
有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的
生物学活性(称非必需部分的修饰); 但大多情 况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧 失)。
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：
1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。
一）、蛋白质功能基反应性的影响因素
蛋白质的修饰反应都是亲核反应。被修饰蛋
三）、修饰剂反应性的决定因素
1. 选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的 特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时 可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。
2. 静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引 到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使 修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向 双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制 修饰作用。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：
A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇， 与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至 消除； “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、 抗体结合。
4.3、化学修饰的种类
一．表面修饰 二．内部修饰 三．与辅因子相关的修饰 四．物理修饰
五．亲和修饰
一、表面修饰
1. 化学固定化 2. 小分子修饰 3. 大分子修饰 4. 肽链的交联
1、化学固定化
通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价 连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，
酶的性质也相应发生改变。
苯乙二醛
5）、酚基和羟基（—OH）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、 Tyr
羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同
时修饰羟基、氨基和巯基 Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼 一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性， 能发生亲电取代反应
修饰反应 —— 酚基和酚羟基
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑
基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代：
•
I2＋
+ HI
硝化：
• (NO2)4C
+
+(NO2)3CH
第四章 蛋白质与酶的化学修饰
4.1、概述 4.2、化学修饰的设计 4.3、化学修饰的种类 4.4、修饰酶的性质及特点 4.5、化学修饰的应用
4.6、化学修饰的局限性
4.1、概述
目前为止尽管人类已经发现了数千种酶, 但是真正具有商业价值即每年销售额可超过
wk.baidu.com
1000万美元的酶不过数十种,为什么？
一、限制酶的应用的原因
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小、性状、亚基数等 （3）酶侧链基团的性质及其反应性 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、 胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等
二、修饰剂的要求
1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质 的吸附性
2.小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子 侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主
要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的
侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有： 1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作 用 2、基团之间的障碍（位阻效应）
3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、
旋转自由度等
二）、蛋白质功能基的超反应性
超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂
能发生非常迅速的反应。
5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时： ①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢 键等维持天然构象的平衡力 ②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态 和它们之间的相互结合及作用方式 许多大分子修饰剂本身就是多聚电解 质，能在酶分子表面或微环境区域形成 一 层“缓冲外壳”。
4.2、化学修饰的设计
一、酶性质的了解
例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电 状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电 荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备： 选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性条件下进行； 所标记的残基在肽链中稳定以易于分离 鉴定； 修饰反应的程度能简单测定；
三、反应条件的选择
酶的化学修饰（chemical modification）：
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
四、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后）
酚基亲电取代反应
碘化反应
四硝基甲烷(TNM)
修饰反应 —— （酚）羟基
O-酰基化反应
乙酰化
乙酸酐
电荷消失
芳基化
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)
电荷消失
电荷消失
芳基化
2,4一二硝基氟苯(DNFB) 碘代乙酸(IAA) 醛
烷基化 引入负电荷 还原 烷基化 芳基化 引入正电荷 电荷消失
丹磺酞氯(DNS)
2）、 羧基（—COOH）修饰 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 — COOH，以及肽链的末端羧基
1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
五、酶化学修饰的原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与 酶形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。 2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮 盖”了酶的活性部位。
修饰剂： 2 ， 4 －二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙 酰胺等。
烷基化反应
2) 酰基化反应
试剂特点：
含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（ Ser 、 Thr ），酚 羟基（Tyr）
酰基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子 的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（ Lys ， Arg ），巯基（ Cys ），羧基（ Asp 、
Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
对氯汞苯甲酸(PMB)
2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)
可容许低浓度蛋白质的光 谱定量分析
250 nm处有 最大光吸收
修饰反应 —— 巯基
S-烷基化反应
同时会使氨基乙酰化
碘代乙酸(IAA)
300 nm处 有最大光 吸收
N一乙基马来酰亚胺(NEM)
4） 胍基（—N=C(NH2)2）修饰 胍基存在于酶蛋白的 Arg 残基侧链上
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠
近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适 pH发生偏移。 糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5， 与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖 浆生产工艺。
载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统
Km增加，反之，Km降低。 增加酶分子构象稳定性。
在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起 重要作用
胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般
采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或 弱碱性条件下反应，一般是可逆反应
修饰反应 ——
需在黑暗中进行, 因其可作为光 胍基（与邻二酮的反应） 敏剂破坏Trp\His\Tyr等残基
硼酸盐
丁二酮
硼酸盐 1,2-环己二酮
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量 不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时 酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。 由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些 非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例
2、修饰剂上反应基团的数目及位置 3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件 一般要求较大分子量、良好的生物相容性 和水溶性、分子表面有较多反应活性基团； 试剂的选择—要根据修饰目的选择
例如对氨基修饰可有几种情况——
修饰所有氨基而不修饰其它基团； 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基； 修饰具有催化活性的氨基；
（四硝基甲烷）
特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
氨基修饰（Lys）
羧基修饰（Asp、Glu） 巯基修饰（Cys）
胍基修饰（Arg）
羟基修饰（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修饰（His） 吲哚基修饰（Trp） 甲硫基修饰（Met）
二硫键修饰
亲和修饰
1）、 氨基（—NH2）修饰 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽链末 端氨基 非质子化的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选 择性修饰 一般情况下 -NH2 的 pKa = 10，其解离程度取 决于微环境 氨基的修饰反应主要有N-烷基化等
1、稳定性不够，不能适应大量生产的需 要。 2、作用的最适条件不符。 3、酶的专一性 4、米式常数过大 5、临床应用的特殊要求 6、酶活性不够高
二、改变酶特性有两种主要的方法
1)通过化学修饰的方法来改变已分离出来
的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
三、酶化学修饰的概念
硼氟化三甲洋盐
甲醇
3）、巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的 -SH 巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性 最高的基团 巯基容易被氧化成 —S—S—，在维持蛋白亚基 之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的 修饰产物
修饰反应 —— 巯基
二硫键置换反应
常用于定量测定蛋白质分子-SH 数目、研究-SH的改变程度和SH所处的环境。
5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB) 又称Ellman试剂
TNB 412 nm处
有强吸收
4,4‘-二硫二吡啶（4-PDS） 324 nm处 有吸收
修饰反应 —— 巯基
与含汞有机物的反应（—SH 对 Hg 的亲和力很强）
在水溶液中，—COOH 通常解离成负离子，亲核
性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、 成酰胺反应
修饰反应 —— 羧基
碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）
碳二亚胺
R, R‘为烷基；X为卤素
修饰反应 —— 羧基
酯化反应
胃蛋白酶与[14C]硼氟 化三甲洋盐在pH 5时 酶完全失活，研究表 明两-COOH为该酶必 需基团