动物DNA限制性片段长度多态性分析
末端限制性片段长度多态性分析技术在鸭肠道微生物群落结构研究中的应用
末端限制性片段长度多态性分析技术在鸭肠道微生物群落结构研究中的应用杨为敏，孟玉学*（汝州市中等专业学校，河南汝州467500）文章编号：1004-2342（2023）03-0019-04中图分类号：S834文献标识码：A随着人们对动物消化道微生物的认识不断深入，鸭肠道微生物群落的研究也变得越来越重要。
鸭肠道微生物群落是指生活在鸭肠道内的微生物群体，是鸭消化系统的重要组成部分[1]。
鸭肠道微生物群落的组成和功能对于鸭的健康和生产性能具有重要影响。
因此，深入研究鸭肠道微生物群落的结构和功能，对于提高鸭的生产性能和保障鸭肉质量具有重要意义。
鸭肠道微生物群落是由细菌、真菌、古菌、原生动物等多种微生物组成的[2]。
这些微生物在鸭肠道内形成复杂的生态系统，相互作用，共同参与鸭的消化、吸收和免疫等生理过程。
鸭肠道微生物群落有多种功能。
一是促进鸭的消化和吸收：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够分解鸭无法消化的食物成分，产生一些有益的代谢产物，如短链脂肪酸、氨基酸和维生素等，这些代谢产物能够被鸭吸收利用，提高鸭的营养水平；二是维持肠道健康：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够抑制有害菌的生长，保持肠道微生态平衡，减少肠道疾病的发生；三是调节免疫功能：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够调节鸭的免疫功能，增强鸭的免疫力，提高鸭的抗病能力[3]。
末端限制性片段长度多态性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism ，TRFLP ）是一种基于PCR 扩增的DNA 指纹技术，可用于研究微生物群落的结构和多样性[4]。
该技术利用末端限制性酶对PCR 扩增产物进行酶切，得到一系列不同长度的DNA 片段，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最终形成一条DNA 指纹图谱。
TRFLP 技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，已广泛应用于微生物群落结构的研究[5]。
本研究旨在通过TRFLP 技术分析鸭肠道微生物群落的结构和多样性，探究不同饲养方式和饲料对鸭肠道微生物群落的影响，为鸭肠道微生物群落的调控提供理论依据。
RFLP限制性片段长度多态性
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RFLP中应用的限制性内切酶
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限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，丌同的内切酶可辨认并作用亍特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
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RPLF技术的原理
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利用特定的限制性内切酶识别并切割丌同生物个体的基因 组DNA，得到大小丌等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上丌同酶切位点的分布 情冴。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成丌同带，然后不兊隆 DNA探针迚行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由亍丌同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切収生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
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数据分析
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（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中叏出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。
动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。
提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。
mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。
在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。
更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。
生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。
ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。
强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。
DNA鉴定方法
DNA鉴定方法DNA鉴定方法DNA鉴定是一种通过对DNA序列的比较分析，确定个体之间的亲缘关系或确认身份的方法。
DNA鉴定在刑侦、亲子鉴定、遗传病诊断等领域有广泛应用。
本文将介绍DNA鉴定的基本原理和常用方法。
DNA鉴定的原理在于人类DNA的独特性和遗传性。
DNA是一种包含遗传信息的分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们按照一定的规则排列成两条螺旋状的链。
每个人的DNA序列都是独一无二的，除了一些双胞胎之外。
鉴定方法主要利用DNA的这种独特性，通过比较个体的DNA序列，确定是否具有亲缘关系或是否为同一人。
常用的DNA鉴定方法包括：1. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：RFLP分析是DNA鉴定的经典方法之一。
它通过利用限制性内切酶将DNA切割成多个不同长度的片段，然后使用凝胶电泳将这些片段进行分离，并利用射入探针的杂交方法进行检测。
不同个体之间的DNA序列差异会导致不同的片段长度，从而可以通过比较片段长度来确定个体之间的亲缘关系。
2. PCR（聚合酶链式反应）分析：PCR是一种快速有效的DNA复制技术，可以从微量DNA中扩增出足够数量的DNA片段用于分析。
PCR分析常用于亲子鉴定、法医学和遗传病诊断。
PCR分析通常配合其他技术如序列分析、飞行时间质谱和DNA芯片等来进行。
3. STR（短串联重复）分析：STR分析是目前最常用的DNA 鉴定方法之一。
STR序列是由2-6个碱基重复单元组成的，不同个体之间的STR序列重复单元数目存在差异。
STR分析通过PCR扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分离，并通过比较STR重复单元数目来鉴定个体之间的亲缘关系或身份。
DNA鉴定的过程包括取样、提取DNA、扩增DNA片段、分离和检测。
取样可以采用血液、口腔拭子、毛发等样品。
提取DNA需要将样品中的DNA从细胞核和细胞器中分离出来。
DNA扩增通过PCR技术，可以在短时间内从微量DNA样品中复制出大量DNA片段。
DNA多态性分析基础详解
DNA多态性分析基础详解DNA多态性分析（Polymorphism Analysis of DNA）是一种用以研究个体之间基因组差异的分析方法。
DNA多态性是指DNA序列的差异，这些差异可能会导致个体之间的遗传差异。
DNA多态性可以作为人类遗传学、分子进化学和医学研究的重要工具之一DNA多态性分析可以通过不同的方法进行。
其中常用的方法包括限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、单点突变（Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 分析、序列分析和扩增子长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等。
RFLP是一种具有高度位点特异性的分析技术。
这种方法是基于限制酶特异性切割DNA，然后通过电泳将产生的DNA片段分离，并通过染色剂将其可视化。
RFLP可以用于检测DNA序列的特定变异位点，从而确定个体之间的差异。
SNP分析是目前最常用的DNA多态性分析方法之一、这种方法利用PCR扩增待检测的DNA片段，然后使用特异性引物结合DNA序列进行扩增。
产生的扩增产物将通过电泳分离，并通过测序或其它方法来检测SNP位点的具体变异。
序列分析是一种直接检测DNA序列的方法。
它利用测序技术来确定个体之间的差异，通常应用于长序列的DNA分析。
序列分析可以提供更精确的结果，但是相对较为耗时和费用较高。
AFLP则是一种无需基因序列信息即可研究DNA多态性的方法。
这种方法将限制酶切割DNA，然后使用引物对产生的DNA片段进行扩增。
产生的扩增产物经过电泳分离并可视化，从而了解个体之间的差异。
DNA多态性分析在人类遗传学研究中具有广泛的应用。
它可以用于亲子鉴定、个人特征分析、基因功能研究以及疾病易感性筛查等领域。
在医学研究中，DNA多态性分析可以用于确定特定基因变异与特定疾病之间的关系，从而为疾病的早期诊断和个体化治疗提供依据。
DNA标记及其在动物遗传育种中的应用
DNA标记及其在动物遗传育种中的应用DNA标记及其在动物遗传育种中的应用西南民族学院畜牧兽医系钟金城摘要DNA标记是近年来出现的一种新的遗传标记,它在动植物育种中具有广泛的应用前景。
本文讨论了DNA标记的发展现状及其在动物育种中的应用。
关键词DNA标记动物育种遗传标记(genetical marker)是基因型的一种特殊表现形式。
主要有形态标记、生化遗传标记、细胞遗传标记和DNA标记4种类型。
而应用于动物遗传育种中的理想遗传标记应具备以下几个条件:(1)具有丰富的遗传多态性;(2)与目标性状有紧密的连锁;(3)经济方便,简单的遗传方式,容易检测,能鉴别出纯合基因型与杂合基因型,或是高遗传力的数量性状;(4)能在生命的早期表现出来,且终身不变。
比较而言,在4种遗传标记中DNA标记是最能满足这些条件的一种。
自1980年以来,在人类基因组计划(HGP)的影响下,DNA标记技术发展迅速,相继建立了限制性片段长度多态性(RFLP)、DNA指纹图谱、位点特异小卫星和微卫星、随机扩增DNA多态性(RAPD)、等位基因DNA序列分析等专门技术。
并且已开始应用于动植物育种中,即所谓的分子育种(molecular breeding)。
1 DNA标记及其发展DNA标记是以DNA分子多态性为基础的反映基因组某种变异特征的一种遗传标记。
生物的遗传信息储存于染色体和细胞器基因组的DNA 序列中。
虽然生物能快速、准确地复制自己的DNA,把遗传信息一代一代地遗传下去,保持遗传性状的稳定性,但有许多内外因素能影响DNA复制的准确性,使DNA分子产生多种多样的变化,小的可能是一个碱基的变化,大的可能由于倒位、易位、缺失或转座而引起DNA分子多个碱基对的变化。
因此,DNA分子中,具有极其丰富的遗传多态性,以这种多态性为基础的DNA标记有可能达到生物遗传标记数的最大极限。
1953年沃森(Watson,J.D.)和克里克(Crick, F.H.C)提出了DNA分子双螺旋结构模型,预言了DNA的遗传特性,宣布了分子遗传学时代的到来。
生物学中的个体基因分型技术
生物学中的个体基因分型技术随着生物技术的不断发展，基因分析已成为生物学及医学领域重要的技术手段。
而在基因分析技术中，个体基因分型技术则是其中的核心内容，它是指对个体基因组的分析，并确定其基因型的一系列操作方法。
在本文中，我们将介绍个体基因分型技术的相关知识。
一、概述个体基因分型技术是指利用各种分析方法和技术，针对个体的基因组进行基因分析，并确定其基因型，以了解个体基因信息的一种技术。
目前，个体基因分型技术的应用已非常广泛，包括了基础研究、生物进化、种群遗传学、医学、动植物育种等各个领域。
二、常用技术1.聚合酶链式反应（PCR）PCR技术是一种非常重要的基因分析技术，其本质是一种“扩增”技术，也就是说，通过指定引物序列对靶序列进行扩增，从而得到所需要的基因片段。
PCR技术的核心是引物设计和适当的温度控制，它可以在短时间内扩增出数量可观的DNA片段。
因此，PCR技术已成为了生物学中非常重要的技术之一，被广泛应用于基因分型、DNA克隆等领域。
2.限制性片段长度多态性分析（RFLP）限制性片段长度多态性分析技术是基因分型技术中非常常用的一种技术。
这种技术通过使用限制性内切酶对DNA分子进行“剪切”，然后将得到的DNA片段进行分析，可以得出指定基因的多态性信息。
其实，RFLP技术在基因组学研究中是非常早期的一种技术，在现在的基因分析中已经被更高效的技术所取代。
3.序列特定引物扩增（SSR）序列特定引物扩增技术是另一种非常常用的基因分析技术。
所谓SSR技术，就是根据目标序列设计一对短的引物，引物的两端含有与目标序列特异性的序列，通过特定条件下的PCR扩增，可以获得目标序列的片段。
SSR技术因其操作简便、结果可信、多态性高等特点，已被广泛应用于生物学中各个领域的基因分型研究。
三、应用举例1.草履虫种群遗传学分析草履虫是一种单细胞有机生物，其种群在自然界中分布广泛。
因此，草履虫成为了一种非常适合进行种群遗传学研究的模型生物。
限制性片段长度多态性课件
在法医学中的应用
限制性片段长度多态性在法医学中发挥了重要作用，它可以帮助解决犯罪案件和 身份识别问题。
通过分析犯罪现场留下的DNA样本，限制性片段长度多态性分析可以提供有关嫌 疑人的遗传信息，有助于缩小嫌疑人范围或确认身份。此外，它还可以用于失踪 人员身份的鉴定和遗产纠纷等问题的解决。
限制性片段长度多态性的实验
限制性片段长度多态 性课件
目录
• 限制性片段长度多态性概述 • 限制性片段长度多态性的应用 • 限制性片段长度多态性的实验技术 • 限制性片段长度多态性与疾病关联
研究 • 限制性片段长度多态性的研究展望
01 限制性片段长度多态性概述
定义与特点
定义
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一种基于限制性酶切和电泳技术检测DNA片段长度变异的方法。
环境因素与疾病关联研究
环境因素对疾病的发生和发展起着重 要作用。
RFLP技术可以用于研究环境因素与特 定RFLP位点的关联，有助于揭示环境 因素对疾病的影响和作用机制。
限制性片段长度多态性的研究
05
展望
新技术的应用
基因组学技术
随着基因组学技术的不断发展， 如全基因组关联分析、基因组测 序等，将有助于更深入地研究限 制性片段长度多态性的遗传机制
03
技术
酶切技术
01
限制性酶切
使用限制性酶对DNA进行切割，产生特定长度的DNA 片段。
02
酶切位点
限制性酶具有特定的识别和切割序列，从而产生具有特 定末端的DNA片段。
03
酶切效率
限制性酶的切割效率受多种因素影响，如DNA序列、酶 浓度和反应温度等。
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一根本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目的DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中别离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目的片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目的DAN，选择适宜的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
假如有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)别分开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上枯燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
分子生物学鉴定方法
分子生物学鉴定方法
分子生物学鉴定是一种通过分析生物体内的分子结构和序列来区分不同生物种类或个体的方法。
常见的分子生物学鉴定方法包括：
1. PCR（聚合酶链反应）：通过特定引物和DNA聚合酶酶，使特定基因片段在体外扩增成百万倍，从而可以快速检测和鉴定目标物种。
2. DNA测序：通过测定DNA序列，可以准确地确定物种的遗传信息和进化关系，从而进行鉴定。
3. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：通过酶切不同物种的DNA，然后利用凝胶电泳，观察DNA片段的大小差异，来鉴定不同物种。
4. DNA条形码：通过选择具有高保守性和变异性的基因片段，利用PCR或测序技术进行鉴定。
常用的DNA条形码基因包括COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基）、rbcL（核糖体大亚基L1）等。
5. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）：将PCR扩增的DNA 产物经限制性酶切，然后通过凝胶电泳等方法分析切割产物的大小和形状，从而鉴定物种。
6. 实时荧光PCR：通过引入荧光标记的探针，在PCR反应的同时测量荧光信号，
可以快速、准确地检测和鉴定目标物种。
这些方法根据不同的研究目的和实际应用的需要，可以单独使用或联合使用，以提高鉴定的准确性和可靠性。
限制性片段长度多态性实验(RFLP)
实验限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：10xM buffer 1 μLddH2O 5.5 μLHind Ⅲ0.5 μLPCR产物 3 μL37℃水浴消化2h ，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTTTTCGA ↑A ABAA BB 2000 7505002501000100。
生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧
生物大数据分析中的遗传多态性检测方法与技巧遗传多态性是生物学研究中非常重要的一个概念，它指的是个体或群体基因组中存在的多个变异形式或等位基因。
遗传多态性不仅与个体间的差异有关，还与个体在适应环境和抵抗疾病方面的差异密切相关。
因此，在生物大数据分析中，准确检测和分析遗传多态性至关重要。
本文将介绍一些常用的遗传多态性检测方法与技巧。
1. 单核苷酸多态性（SNP）的检测方法：SNP是最为常见的遗传多态性形式之一，它是DNA中单个核苷酸（A、T、C或G）的变异。
SNP的检测可通过基于测序技术的方法，如Sanger测序、测序用探针芯片和下一代测序技术等。
这些方法可以快速、准确地检测出SNP位点上的碱基变异情况。
此外，还可以利用聚合酶链式反应（PCR）结合限制性内切酶（RFLP）方法，通过分析产生的DNA片段长度差异来检测SNP位点。
2. 微卫星序列的分析方法：微卫星序列是在基因组中广泛分布的、重复的DNA序列，由于个体间的插入、缺失或重复次数的差异，微卫星序列具有高度多态性。
检测微卫星序列的多态性可以通过PCR扩增方法，使用特异性引物扩增目标微卫星位点，然后通过电泳检测扩增片段的长度差异。
此外，还可以利用基于测序的方法来检测微卫星序列的变异情况。
3. 多态性标记的选择与筛选：在生物大数据分析中，选择适当的多态性标记对于准确检测遗传多样性至关重要。
一种常用的多态性标记是限制性片段长度多态性（RFLP），其基本原理是利用限制性内切酶切割DNA产生的不同长度的片段。
此外，还有单序列重复多态性（SSR）和随机扩增多态性（RAPD）等多态性标记可以选择。
在筛选多态性标记时，通常考虑标记的多态性、位点的连锁关系、扩增效果等因素。
4. 基于群体遗传学的分析方法：群体遗传学是研究个体在群体中遗传结构和动态变化的学科。
在生物大数据分析中，利用群体遗传学的方法可以检测遗传多样性和演化过程。
例如，可以通过计算群体间的遗传距离和群体结构来判断不同种群间的基因流程度。
限制性片段长度多态性 RFLP课件
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三种限制性内切酶
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I型酶
II型酶
如酶的识别位点上 两条DNA链均未甲 基化，就行使内切酶 功能，但切割点不在 识别位点，而在1kb （不少于400bp）或nk b(最多7kb)处随机切割.
限制性片段长度多态性 RFLP
限制性片段长度多态性RFLP
1 RFLP技术的简介 2 RFLP中应用的限制性内切酶 3 RFLP的实验步骤 4 RFLP技术的应用
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分子标记的历史
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第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，
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RPLF技术的简介
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个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有 重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异 成为DNA多态性。
假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。 这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与 正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现 不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。
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RFLP的类型
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1.点的多态性
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有
利用RFLP和SNP技术分析DNA多态性分布规律
利用RFLP和SNP技术分析DNA多态性分布规律DNA是构成生命体的基本单位，其中含有许多基因，而基因的不同组合会导致种种特征和性状的产生。
因此，研究DNA序列和多态性，对于生物学和医学方面有着重要的意义。
某些疾病的发生与特定基因的突变息息相关。
体内的基因代表了人类的遗传信息，正是基因的多样性使人类具有巨大的遗传潜力。
遗传多样性的确定对于群体的进化历程、疾病的筛查和纯种物种的鉴别等领域都具有着重要的意义。
因此，在这篇文章中我将主要介绍两种比较常见的DNA多态性技术-- RFLP和SNP技术。
1. RFLP技术的原理与应用RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism 受限制酶切片段长度多态性）是利用特异性内切酶切割某位点DNA，生成不同长度的DNA片段，从而观察不同酶切型的频率分布。
其原理是分子杂交，即使用已知序列的探针与限制性酶切割的DNA片段杂交，然后进行电泳分离，以显示出探针的目标序列的多态性。
RFLP技术已经被广泛应用于分子进化学、生物物种鉴定、遗传精准诊断、疾病的遗传分析等领域。
例如，曾经报道了RFLP技术被用来鉴别非洲大象品种、判断植物中基因组DNA序列的差异性、生物种群和群体间的基因多样性等等。
2. SNP技术的原理与应用SNP（Single Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性）是DNA多态性中最为常见的一种类型，通常发生在DNA中一对核苷酸(A-T、G-C)的一侧发生单碱基的变异，其最小可检测到5-10bp的单核苷酸差异，不同SNP型频率的多态性遗传在遗传学研究中具有重要作用。
SNP是目前最主要的基因标记类型之一，也是最常见的遗传变异形式之一。
SNP的检测方法主要有MassARRAY(Agena Bioscience)和TaqMan(Thermo Fisher Scientific)。
SNP技术已经广泛应用于人类遗传研究、医学和农业等领域。
小鼠基因型鉴定结果
小鼠基因型鉴定结果引言基因型鉴定是通过对生物体的基因进行分析，确定其基因组的具体构成。
小鼠是一种常见的实验动物，在科学研究中广泛应用。
基因型鉴定结果可以为科学家提供关于小鼠遗传特性的重要信息，有助于深入研究小鼠的生物学特性以及与人类疾病之间的关联。
小鼠基因型鉴定方法小鼠基因型鉴定的方法有很多种，其中常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、单核苷酸多态性分析（SNP）等。
这些方法可以通过特定的试剂和实验步骤，对小鼠的基因进行扩增、分离、测序等操作，最终得到基因型鉴定结果。
PCRPCR是一种常用的基因型鉴定方法，通过扩增目标基因片段，从而得到足够的DNA样本进行后续分析。
PCR的原理是利用DNA聚合酶酶解DNA双链，然后引物与目标序列特异性结合，DNA聚合酶在引物的作用下合成新的DNA链。
通过多轮循环反应，可以在短时间内扩增出大量目标基因片段。
RFLPRFLP是一种通过酶切DNA片段的方法进行基因型鉴定。
在RFLP分析中，首先将DNA样本进行限制性内切酶消化，然后通过凝胶电泳将酶切后的DNA片段进行分离。
由于不同基因型的DNA片段长度存在差异，因此可以通过凝胶电泳的结果判断小鼠的基因型。
SNPSNP是单核苷酸多态性分析的缩写，是一种通过检测DNA序列中单个碱基的变异来进行基因型鉴定的方法。
SNP分析可以通过PCR扩增目标区域的DNA片段，然后利用测序技术对扩增产物进行测序，最终确定小鼠的基因型。
小鼠基因型鉴定结果的意义小鼠基因型鉴定结果对于科学研究具有重要意义。
首先，基因型鉴定可以帮助科学家确定小鼠的遗传特性，包括其携带的基因突变和变异，这些特性对于深入研究小鼠的生物学功能至关重要。
其次，基因型鉴定结果可以为研究人员提供关于小鼠模型的有效性和可靠性的信息，有助于确定小鼠是否适合作为特定疾病模型的研究对象。
最后，基因型鉴定结果还可以为研究人员提供有关小鼠与人类疾病之间的关联的线索，有助于揭示疾病的发病机制和寻找新的治疗方法。
【国家自然科学基金】_限制性片段长度多态性分析_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
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科研热词 多态性 基因多态性 单核苷酸多态性 遗传多态性 单核苷酸 限制性片段长度多态性 多态性,单核苷酸 基因型 pcr-rflp 食管癌 血脂 肝炎病毒,乙型 维吾尔族 等位基因 易感性 微生物群落 基因 髓过氧化物酶 骨质疏松症 预后 非综合征型唇腭裂 遗传变异 过氧化氢酶 谷胱甘肽硫转移酶 肥胖 维生素d受体基因 结核病 线粒体dna 精神分裂症 突变 疾病易感性 生物力学 心肌梗死 多态现象,遗传 多态性,限制性片段长度 乙型肝炎病毒 ⅰ型胶原 t-rflp 鼻咽肿瘤 高血压 高脂血症:痰瘀证 高分辨熔解曲线分析 骨髓增生异常综合征 食管鳞状细胞癌 食管肿瘤 非综合征耳聋 非综合征性唇腭裂 非吸烟女性 雌激素受体α 基因 隐球菌 限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度
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动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。
动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman1983）。
提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。
mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。
在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。
更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。
生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。
ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。
强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。
生物ESUs已被证明是一个在保护中很有用的概念标准。
例如，在我们最近的一项研究中，发现广西的白头叶猴（Trachypithecus francoisi leucocephalus）和黑叶猴（T．f．francoisi）在mtDNA序列上严格地互为单系群（Wang等 1996），这明确地说明了白头叶猴是保护中应受到重视的一个ESU S。
核糖体DNA（ribosomal DNA，简称rDNA）是一类中等重复的核内DNA序列，每个重复单元（repetype）由非转录间隔区（non-transcribed spacer，简称 NTS）、转录间隔区（internal transcribed spacer，简称 ITS）和3种RNA（18S RNA，5.8S RNA，28S RNA）基因编码区 组成。
这3个区域的DNA序列有不同的进化速率，编码区非常保守，适合于构建生命系统树的基部分枝；转录间隔区则中度保守，适合于推断50×106年前左右的事件；非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间和已有隔离的群体间关系的研究（Appels， Honeycutt 1986；Hillis，Davis 1986；Suzuki等 1990）。
此外，rDNA以一种协同的方式进化，在个体内和群体内有着较好的均质性（homoplasmy）。
因此，有人认为，少量个体的抽样就能有效地代表本章作者：王 文，陈永久，兰宏110 遗传多样性研究的原理与方法其来源群体DNA的变异情况（Dover，Coen 1981；Hillis，Davis 1986）。
rDNA重复单位的大小还正好在RFLP易于检测的范围之内（Kominami等 1981；Hillis，Davis 1986）。
上述特点使rDNA 成为动物遗传分化研究中一个有用的核内遗传标志（Hillis， Davis 1986；Suzuki等 1990a，1990b；兰宏等1993）。
本章将介绍我们实验室常用的线粒体DNA和核糖体DNA限制性片段多态性的检测技术和数据分析方法。
9.2 动物线粒体DNA提取和酶切线粒体DNA（mtDNA）已被广泛用于动物群体遗传学和进化生物学的研究，并取得了令人瞩目的结果（Harrison 1989）。
有效的mtDNA提取方法无疑是开展这方面研究的前提。
关于动物mtDNA 的提取，国内外已报道了不少方法。
概括起来可分为：①氯化铯超速离心法（Lansman 1983）；②柱层析法（赵邦悌 1983）；③DNase法（俞民澍等 1987）；④碱变性法（Tamura等 1988；Afonso 等 1988）。
这些方法各有其特点，也都有其局限性。
我们参照Tamura等（1988）的碱变性法加以改进，建立了一种有效、快速的动物mtDNA提取方法（王文，施立明 1993）。
9.2.l 实验材料要求用液氮长期冻存（－196℃）、或在普通冰箱冷冻室内保存（－10℃）、或放在冰壶（4℃）中短期内运送至实验室的材料均可，但－20℃以上长期保存的样品效果往往不是很理想。
9.2.2 试剂及溶液试剂：十二烷基硫酸钠（SDS），如为国产或进口分装，用前最好重结晶；醋酸钾（KAc），上海化学试剂一厂，化学纯或分析纯，化学纯注意百分含量的折算；限制性内切酶可根据需要和方便向国内外几家生化试剂公司订购；国产琼脂糖须预检测各批号的质量。
SE缓冲液（或称匀浆缓冲液）：0.25mol／dm3蔗糖，30mmol／dm3Tris-HCl，10mmol／dm3 Na2EDTA，2.5mmol／dm3CaCl2 ，pH值 7.3～8.l。
溶液1：TEN：10mmol／dm3Tris-HCL，10mmol／dm3Na2EDTA，0.15mol／dm3NaCl，pH值 8．0；或 GTE：1％葡萄糖，25mmol／dm3 Tris-HCl，50mmol／dm3Na2EDTA，pH值 8.0。
溶液2：l％SDS含 0.2mol／dm3 NaOH（用时用 10％SDS和 1mol／dm3 NaOH新配制）。
溶液3：KAc溶液，其中含 3mol／dm3 K，5mol／dm3 Ac（详见 Maniatis 1982）。
上述溶液最好用母液配制。
9.2.3 操作程序（1）取 2～15克（视动物种类而定）动物组织或整体于少量 SE液中剪碎（或研磨碎），加约 50ml SE液，用电动匀浆器以 1500r／min上下匀浆 15次（质硬的组织剪碎后先用纱布过滤，再用匀浆器匀浆）。
（2）将匀浆好的匀浆物转至离心管，3 000r／min离心 10分钟，沉淀核及细胞碎片。
（3）取上清液，12 000r／min离心 15分钟，沉淀线粒体。
第9章动物DNA限制性片段长度多态性分析111（4）弃上清液，加4mlSE液，以悬浮线粒体，然后将溶液倒入 4个1.5ml离心管中，每管1ml。
（5）12 000r／min离心 8分钟，弃上清液。
每管加 150µl溶液 1，悬浮线粒体（振荡、吹打均匀）。
（6）往试管中各加 300µl新制的溶液2，混匀，冰浴10分钟。
（7）往试管中各加 225µl冷溶液 3（4℃），混匀，冰浴25分钟。
（8）12 000r／min离心 6分钟。
取上清液，加入半倍体积的水饱和酚，室温下振荡 30分钟后，加原上清液1／2体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分混匀。
（9）2 000r／min离心 8分钟。
取水相，加等体积的异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，冰浴30分钟或更长时间。
（l0）12 000r／min离心 10分钟。
用70％冷乙醇（4℃）洗涤沉淀。
12 000r／min离心 2分钟，然后真空或自然干燥。
（11）加适量体积的TE（其中可含 20µg／ml DNase-free的RNaseA），在－20℃下保存。
9.2.4 mtDNA样品的酶解和检测（1）琼脂糖凝胶的制备：用 1×TAE或 TBE电极缓冲液配制1.0％的琼脂糖凝胶，置电 磁搅拌器上或微波炉中加热搅拌至溶液完全透明。
将胶放置冷却至50～60℃， 加入终浓度为0.5µg／ml的溴化乙锭（EB），混匀后把胶液倒入已封口的载胶板上，待完全凝固后放入电泳 槽中待用。
（2）限制性内切酶消化：用上述方法制备的mtDNA样品可容易地进行限制性内切酶分析。
酶切反应体系总体积一般使用 20µl，其中含mtDNA 0.5µg左右，加无菌双蒸水至 17µl，然后加入2µl酶解缓冲液，内切酶用量为4～1O个单位，在37℃下作用4～8小时，最后加入1／5体积的载样缓冲液（50mmol／dm3 EDTA，pH值 8.0，50％甘油，0.25％溴酚蓝）以终止酶解反应。
（3）琼脂糖凝胶电泳：用Gilson微量进样器小心地把消化后已加载样缓冲液的样品，加入到琼脂糖凝胶的点样孔中，凝胶预先已浸泡在TAE或TBE电极缓冲液中。
点样后，用5～8V ／cm的恒压电泳10小时左右。
在紫外线检测仪上拍照，并记录结果。
9．3 核糖体DNA RFLP的检测9.3.1 试剂Digoxigenin-DNA标记及检测试剂盒均购自Boehringer-Mannheim生化试剂公司，其余 试剂是市售最高纯度的商业产品。
9.3.2 操作步骤9.3.2.1 总 DNA提取总DNA的提取依照本实验室改进的方法（王文等 1994）进行。
具体操作如下：在50mg112 遗传多样性研究的原理与方法组织（剪碎）或 100µl全血或离心沉淀的培养细胞中加入500µl STE缓冲液（30mmol／dm3 Tris-HCl，200mmol／dm3EDTA，50mmol／dm3 NaCl，pH值 8.0），终止浓度分别是：SDS含量 为 1％，蛋白酶K含量为 200µg／ml。
将溶液充分混合后置 56℃下作用。
消化至透明后（通 常需 12小时），加入等体积的水饱和酚，于自制转轮上缓慢转动抽提24小时。
5 000r／min 离心10分钟。
取上清液用苯酚：氯仿混合液（1:1）抽提5小时。
5 000r／min离心后取上清 液用等体积的氯仿：异戊醇（24:1）抽提1小时。
5 000r／min离心后取上清液加入2倍体 积的无水乙醇沉淀 DNA。
DNA干燥后加入适量体积的 TE缓冲液（10mmol／dm3 Tris-HCl，1mmol／dm3EDTA，pH值 8.0）溶解，保存于－20℃下备用。
9.3.2.2 DNA限制性内切酶消化酶解系统的总体积为 15µl，内含1µl左右的DNA，适量的酶解缓冲液和限制性内切酶。