限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性

(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)

一基本原理

各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).

二主要材料

DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。

三方法步骤(图1)

图1

(一) 样本DNA制备

采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。

(二) 限制性内切酶降解样本DNA

根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。该步骤必须保证酶解完全。如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。酶解的时间根据实际情况而定。

(三) 电泳

电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。时间由几小时到24小时不等。

(四) 转印

所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。转印的方法一般有三种。根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。

1 盐桥法；也叫毛细管转移法。先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×

SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。该方法的优点是简单，不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。

2电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。

3真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比盐桥法转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

(五) 烤膜

去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。

(六) 预杂交

将滤膜放入含预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预

杂交3-12小时，弃去预杂交液。预杂交液中并不含有探针，该步的主要目的是减低背景，为杂交作准备。

(七) 探针的制备

探针是一种已知特异性的分子，它的制备首先需要获得所要的特异性的DNA片段。然后再用放射性物质标记，如P32，a-PdNTPd等。用这些物质标记虽然灵敏性高，效果好，但不安全。另外，在试验中还常用地高辛标记，它没有半衰期且安全性好。标记的方法常用缺口平移法、末端标记法、随机引物延伸法和反转录标记法。该步骤必须保证探针的纯度以防止在杂交过程中出现杂带。并且探针在杂交前也要使之变性。

(八) 杂交

在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（六）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。

(九) 洗膜

漂洗去非特异性结合的探针。

(十) 放射自显影和分析

空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可见DNA谱带。然后对谱带进行分析。

四RFLP的主要应用

(一) 遗传图谱和物理图谱的绘制。

所用的探针来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(mark),构建分子图谱。当

某个性状(基因)与某个(些)分子协同分离时，表明这个性状(基因)与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记的距离，从而可将基因定位在分子图谱上。

(二) 系统发育分析

将不同物种的DNA分子进行杂交，可以通过构建系统进化树来确定物种之间亲缘关系的远近。比如，在狐蝠亚科中，主要有两种食性的蝙蝠，即食花蜜狐蝠和食果实狐蝠，通过对这两种食性的物种进行RFLP分析和比较，构建两个物种的系统发育树，就可以确定食果实狐蝠是由食花蜜狐蝠进化而来。

(三) 基因诊断以及疾病基因的检测

在医学上，如果要检验病人的某基因是否发生癌变，可以先制备该基因在正常情况下的cDNA，然后把它与病人的这个基因进行杂交，即通过RFLP分析，就可以确定该基因是否发生癌变。

(四) 亲子鉴定和痕迹检验

在医学实践中，能准确进行亲子鉴定的是DNA检测，检测方法并非检测出全部碱基顺序，而是进行DNA杂交，即把所要检测的两人的卫星DNA进行杂交，再比较差异大小，从而说明两人的血缘关系，如父子、母女等。另外，在公安机关的刑事侦察中，也常用DNA 杂交技术进行痕迹检验。犯罪分子只要留下一丝一毫的身体细胞遗留物，如血液、皮屑、毛发等，技术人员就可以把犯罪嫌疑人的DNA 样本和现场发现的遗留物中提取的DNA样本通过DNA杂交，比较它们是否相同，从而确定现场留下的痕迹是否为犯罪嫌疑人的。