限制性片段长度多态性实验——
RFLP限制性片段长度多态性
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RFLP中应用的限制性内切酶
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限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，丌同的内切酶可辨认并作用亍特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
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RPLF技术的原理
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利用特定的限制性内切酶识别并切割丌同生物个体的基因 组DNA，得到大小丌等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上丌同酶切位点的分布 情冴。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成丌同带，然后不兊隆 DNA探针迚行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由亍丌同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切収生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
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数据分析
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（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中叏出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
末端限制性片段长度多态性技术_T_省略_微生物群体分析上的应用与技术优化_李献梅
中国农业大学学报 2009,14(4):1-9Journal o f China A g ricultur al U niv ersity末端限制性片段长度多态性技术(T -RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化李献梅 王小芬 崔宗均*(中国农业大学农学与生物技术学院/中国农业大学生物质工程中心,北京100193)摘 要 末端限制性片段长度多态性技术(T-RFL P)是以荧光标记引物P CR 为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。
本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DN A 提取、PCR 扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR 、gy r B 基因等相结合的观点。
关键词 T -RF LP ;微生物群体;图谱分析;PCR;克隆中图分类号 Q 936 文章编号 1007-4333(2009)04-0001-09 文献标志码 A收稿日期:2008-10-27基金项目:国家/十一五0科技支撑计划(2006BAD07A 01;2006BA D25B04)第一作者:李献梅,博士研究生,E -mail:staro fchina@g 通讯作者:崔宗均,教授,主要从事生物质资源利用与微生物生态研究,E -mail:acuizj@Applications and optimizations of T -RFLP in fingerprintingenvironm ental microbial populationsLI Xian -mei,WANG Xiao -fen ,CUI Zong -jun *(College of Agronomy and Biotechnology/Center of Biomas s Engineeri ng,Chi na Agricul tural U nivers i ty,Bei jing,100193,China)Abstract Terminal re stric tio n fra gment leng th polymorphis m (T -RFLP)is one o f micro bia l popula tio n fing erprinting me tho ds tha t is ba sed o n labele d primers -PCR to ide ntify microbial co mposition a ccording to diffe re nt terminal re stric tio n frag me nt leng ths.The applic ations and te chnica l o ptimizations we re o ve rv iew ed o f T -RFLP thro ugh the pro cedures of DNA preparation,PCR,enzyme dig estion and da ta analysis.The sc ientific applic ation re quire me nts and new view s of combination with multiple -PCR o r g yr B g e ne we re dra wn.Key words T -RFLP;microbial po pulation;fing erprinting ana lysis;PCR;clone libra ry当前环境微生物组成及生态研究已经成为微生物领域的一大热点[1]。
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析
第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。
动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。
提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。
mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。
在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。
更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。
生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。
ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。
强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。
T-RFLP
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制 性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常 是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限 于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不 等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度 的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同 波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样 品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差 异。
下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序， 用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周 能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个 同组样本 的图谱， 波峰大致 上是相同 的，这样 表明这两 个样本数 据是比较 可靠的。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越 引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术 得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很 大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异 ，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。 由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于 具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的 结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质 地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。
作物基因定位的途径
作物基因定位的途径一、引言作物基因定位是指确定作物基因在染色体上的位置和位置与性状之间的关系。
它是作物遗传学和分子育种的基础，为作物改良提供了重要的理论和技术支持。
本文将从不同角度探讨作物基因定位的途径，并介绍它们的优缺点和应用情况。
二、作物基因定位的途径1.传统遗传学方法•遗传连锁图法：通过分析遗传连锁图，确定染色体上基因的相对位置。
主要方法有三点配子试验法、二点试验法和多点试验法。
•遗传映射法：利用遗传连锁图和群体杂种图，确定基因的绝对位置。
主要方法有连锁不平衡分析和融合连锁分析。
2.分子标记辅助选育方法•RFLP（限制性片段长度多态性）：通过分离、纯化和测定限制性酶切片段，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
•SSR（微卫星标记）：通过PCR扩增微卫星DNA片段，检测其在不同位点的长度变异，确定基因位置。
•SNP（单核苷酸多态性）：通过测定基因组中特定位置上的单核苷酸变异，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
•AFLP（扩增片段长度多态性）：通过PCR扩增剪切DNA片段，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
3.基因组学方法•位置克隆法：将感兴趣的基因从新引入敲除构建中，通过其对敲除的表型进行定位。
•QTL（数量性状位点）定位法：通过连锁分析和基因表达研究，确定数量性状与基因之间的关系。
•基因组关联分析法：通过分析大量群体的基因组序列和表型数据，确定基因组区域与性状相关的位点。
三、作物基因定位的优缺点1.传统遗传学方法的优缺点•优点：简单易行，不需要复杂的实验设备和技术。
•缺点：分辨率较低，需要大量的试验材料和时间。
2.分子标记辅助选育方法的优缺点•优点：高分辨率，可以精确定位基因。
•缺点：成本较高，需要复杂的实验设备和技术。
3.基因组学方法的优缺点•优点：高通量，可以同时分析大量基因和性状。
•缺点：分析结果复杂，需要强大的数据分析能力。
四、作物基因定位的应用情况作物基因定位的途径已经在作物改良中得到了广泛应用。
基因多态性的检测方法
基因多态性的检测方法多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。
在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。
这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。
基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。
最早是用Southern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。
现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。
相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。
在电泳时泳动的速度不同。
将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。
3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。
在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。
其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。
RFLP限制性内切酶片段长度多态性
三、RFLP技术的优点及注意的问题
1、RFLP技术的优点
第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的的时间。
四、RFLP在作物遗传育种上的应用
1、分子水平上选择目的性状
RFLP图本身对植物育种并没有直接的用处，只有当它与经典标记即原已定位的基因结合起来 才有用，当确定哪一个RFLP标记与目的性状表现协同分离，即目的基因与RFLP的连锁，使得 对期望基因重组型的选择容易进行，在分子水平上选择目的性状，不受环境条件遗传背景的 影响，RFLP连锁图谱为育种者们提供了一种高效选择手段，在马铃薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麦类作物上已相继出现RFLP作图的有关报道。育种者们只要选择 了与目的基因紧密连锁的一个或多个RFLP标记，也就选择了目的基因，因为与目的基因连锁 的RFLP标记是易于检测的。这种间接对那些直接选择有困难或过于费时、费力的性状以及在 分离群体中隐性性状的选择特别有效。在番茄中已鉴定的与RFLP标记连锁的基因，有番茄花 叶病毒、镰刀菌、细菌斑和根结线虫的抗性基因及控制植株生长习性(SP)和果实成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮杆花叶病毒抗性基因、莴苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP标记。
3、进行品种或品系遗传纯度的测定
对整个基因组中许多连锁位点上RFLP图谱的了解，则可对某一品种或纯系进行基因型图解， 以代表这一品系具有品种特异性，因此基因组中一些微小变异可以从RFLP图谱的改变监测出 来；所以RFLP图谱技术还可用于种子专利登记中，解决侵权纠纷，在欧洲已为一些商业育种 者用来保护自己的品种权益。
医学分子生物学简答总结(重点)
医学分子生物学简答题基因与基因组真核生物基因组特点（1）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。
约30亿bp（2）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。
（3）基因组存在高比例的非码顺序(non coding sepuence, NCS)（4）大量重复序列（repeat sequence）存在。
（5）基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔，这种现象称为断裂基因（6）功能相关基因构成各种基因家族2.评判蛋白质编码基因的五项标准(1)开放阅读框（open reading frame, ORF）:是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。
;(2)序列特征——密码子偏爱和剪接点;(3)序列保守性：一个功能在不同物种内是保守的基因，大都表现出外显子的保守性和内含子的多变性；最好是对适当进化距离的物种间序列进行比较，但保守性序列也可能是非转录的调控单元。
(4)转录产物:寻找基因的表达产物——RNA或蛋白质.;(5)基因失活。
3.HGP的概念及主要内容、遗传标记答：HGP：测定人类基因组全序列为目标的巨大工程主要内容：（1）人类基因组作图及序列分析(22+X+Y, 30亿bp)；（2）基因的鉴定与定位(约5万个基因)；（3）基因组研究技术的建立和创新；（4）模式生物基因组作图及序列分析；（5）信息系统的建立、储存及相应软件的开发；（6）相关产业的开发。
遗传标记：第一代遗传标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多态性）第二代遗传标记是STR（short tandem repeat，简短串连重复序列），6000个标记，96年已全部完成第三代遗传标记是SNP（restriction fragment length polymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序4.基因组学主要研究亚领域和主要研究内容答：5.DNA多态性的种类，并熟悉其应用答：1）DNA位点多态性(DNA site polymorphism)：这种多态性是由控制某些性状的DNA碱基差异造成的。
限制性片段长度多态性课件
在法医学中的应用
限制性片段长度多态性在法医学中发挥了重要作用，它可以帮助解决犯罪案件和 身份识别问题。
通过分析犯罪现场留下的DNA样本，限制性片段长度多态性分析可以提供有关嫌 疑人的遗传信息，有助于缩小嫌疑人范围或确认身份。此外，它还可以用于失踪 人员身份的鉴定和遗产纠纷等问题的解决。
限制性片段长度多态性的实验
限制性片段长度多态 性课件
目录
• 限制性片段长度多态性概述 • 限制性片段长度多态性的应用 • 限制性片段长度多态性的实验技术 • 限制性片段长度多态性与疾病关联
研究 • 限制性片段长度多态性的研究展望
01 限制性片段长度多态性概述
定义与特点
定义
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一种基于限制性酶切和电泳技术检测DNA片段长度变异的方法。
环境因素与疾病关联研究
环境因素对疾病的发生和发展起着重 要作用。
RFLP技术可以用于研究环境因素与特 定RFLP位点的关联，有助于揭示环境 因素对疾病的影响和作用机制。
限制性片段长度多态性的研究
05
展望
新技术的应用
基因组学技术
随着基因组学技术的不断发展， 如全基因组关联分析、基因组测 序等，将有助于更深入地研究限 制性片段长度多态性的遗传机制
03
技术
酶切技术
01
限制性酶切
使用限制性酶对DNA进行切割，产生特定长度的DNA 片段。
02
酶切位点
限制性酶具有特定的识别和切割序列，从而产生具有特 定末端的DNA片段。
03
酶切效率
限制性酶的切割效率受多种因素影响，如DNA序列、酶 浓度和反应温度等。
山东师范大学生科院生物信息学题库
一、单选题（题数：105，共20.0 分）1<p>限制性片段长度多态性标记是（）A、RFLPB、SNPC、SSRD、RAPD2从cDNA文库中获得的短序列是A、STSB、UTRC、CDSD、EST3orthologs的意思是（）A、并系同源B、旁系同源C、直系同源D、横向同源4LCR的含义是A、编码区B、非编码区C、低复杂度区域D、开放阅读框5HTGS的含义是A、表达序列标签B、序列标签位点C、高通量基因组序列D、人工合成序列6（）年美国国会批准正式启动人类基因组计划?（）年发表草图?A、<p>1990 2004</p>B、<p>1990 2001</p>C、<p>1988 2004</p>D、<p> 1988 2001</p> 7在使用动态规划进行序列比对时，比对结果是唯一的吗？（）A、唯一B、不唯一8Blast结果中HSP的含义是（）A、空位B、期望值C、过滤D、高计分配对片段9RGP是（）A、在线人类孟德尔遗传数据B、国家核酸数据库C、人类基因组计划D、水稻基因组计划10一种替换在自然界中越容易发生，则这种替换在打分矩阵中对应的数值( )A、越小B、越大11如：我要查找RaoY在Nature 或Science上发表的论文,哪一个检索语言是正确的？A、Rao Y[au] AND Nature OR Science[Journal]B、Rao Y[au] AND (Nature[Journal] OR Science[Journal])C、Rao Y[au] AND Nature[Journal] OR Science[Journal]D、Rao Y[au] AND (Nature OR Science)[Journal]12<p style=";margin-bottom:0"><span style="font-size:14px;font-family:OpenSans;color:#333333">序列比对算法哪年出现（）年A、1977B、1988C、1970D、199113微卫星标记是（）A、RFLPB、SNPC、SSRD、RAPD14CDS的含义是A、编码区B、非编码区C、低复杂度区域D、非调控区15下列哪一个是基于字母特征的系统发生分析的算法A、Kimura算法B、邻接法C、最大似然法D、PAUP16序列比对算法哪年出现（）年A、1977B、1988C、1970D、199117PIR是（）A、核酸数据库B、mRNA数据库C、启动子数据库D、蛋白质数据库18下列属于没有同义密码子编码的氨基酸是（）A、精氨酸B、亮氨酸C、甲硫氨酸D、丝氨酸19用遗传学算法对蛋白质序列进行比对软件是（）A、ProbConsB、SAGAC、ClustalWD、T-CoffeeE、MAFFT20DDBJ的含义是A、美国国家生物信息中心B、欧洲分子生物学实验室C、日本DNA数据库D、中国基因组研究中心21如：我要查找RaoY在Nature 或Science上发表的论文,哪一个检索语言是正确的？A、Rao Y[au] AND Nature OR Science[Journal]B、Rao Y[au] AND (Nature[Journal] OR Science[Journal])C、Rao Y[au] AND Nature[Journal] OR Science[Journal]D、Rao Y[au] AND (Nature OR Science)[Journal]22<p>Proteomics的含义是A、生物信息学B、基因组学C、蛋白质组学D、表观遗传学23目前应用于基因芯片表达数据统计分析的主要方法是（）。
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一根本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目的DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中别离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目的片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目的DAN，选择适宜的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
假如有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)别分开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上枯燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
限制性片段长度多态性实验(RFLP)——【RT-PCR技术】
实验六、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：10xM buffer 1 μLddH2O 5.5 μLHind Ⅲ0.5 μLPCR产物 3 μL37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳11 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTTTTCGA ↑AABAA BB 2000 750 5002501000100。
分子标记特点和应用
分子标记技术方法和他们特点1、限制性片段长度多态性标记分析(Re striction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLPRFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生RFLP技术特点：RFLP技术优点：①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。
②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。
③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。
④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。
RFLP技术缺点：①分析所需DNA量较大，分析速度慢。
②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。
③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。
④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。
⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。
但是种以上水平影响很小。
2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）—RAPD以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。
它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
RAPD技术特点：RAPD优点：①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。
②适合于自动化分析。
操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。
限制性片段长度多态性 RFLP课件
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三种限制性内切酶
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I型酶
II型酶
如酶的识别位点上 两条DNA链均未甲 基化，就行使内切酶 功能，但切割点不在 识别位点，而在1kb （不少于400bp）或nk b(最多7kb)处随机切割.
限制性片段长度多态性 RFLP
限制性片段长度多态性RFLP
1 RFLP技术的简介 2 RFLP中应用的限制性内切酶 3 RFLP的实验步骤 4 RFLP技术的应用
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分子标记的历史
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第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，
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RPLF技术的简介
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个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有 重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异 成为DNA多态性。
假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。 这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与 正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现 不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。
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RFLP的类型
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1.点的多态性
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有
RFLP限制性片段长度多态性
❖ 第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机
扩增多态性DNA ）
AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，
扩增片断长度多态性）
❖ 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分 子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
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数据分析
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❖ （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。
❖ （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。
❖ （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
❖ （四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
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RFLP的类型
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❖ 1.点的多态性
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有
酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交
即可诊断。
❖ 2.序列多态性
①由于DNA 顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。
②由于高变区（highly variable region ）内串联重复顺序 的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别 位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中 的相对位置。
❖ DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此， 凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已 断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中 的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。
RFLP,RAPD,ALFP,SSR的原理及示意图
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离3.AFLP原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型：形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）.分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限,而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用.作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段,即分子标记技术。
与其它标记方法相比,分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题;数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的;多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁;许多标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分.广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
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实验六■限制性片段长度多态性
（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）
—、实验目的
学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP ）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等,导致酶切片段大"俊生了变化,这种变化可以通过
PCR ,酶切及琼脂糖凝胶电泳逬行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因走位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试別
（-）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
（二）材料与试列：Hind JU限制性内切酶,10xM Buffer,待分析的PCR产物,DL2000 DNA Marker, 6xLoading Buffer （上样缓冲液），灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溟化乙锭EB ,致癌，请带手套操作）,0.5%TBE （电泳缓冲液1
四、实验步骤
1、Hind m限制性内切酶酶切
反应体积（10pl ）f在0.2ml Eppendorf管中依次加样：
10xM buffer i ML
ddH2O 5.5 pL
Hind 皿0.5 pL
PCR产物 3 ML
37°C水浴消化2h ,消化产物全部用于琼脂糖检i则。
2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10pl酶切产物+1川上样缓冲液280V恒压电泳。
DNA带负电荷, 电泳时
DNA从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2-2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业
写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）
M12 34 5678 9 10
Hind HI内切酶识别位点：AIAGCTT
TTCGATA。