RFLP限制性内切酶片段长度多态性
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3、杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交 的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分 析。
三、RFLP技术的优点及注意的问题
1、RFLP技术的优点
第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的的时间。
四、RFLP在作物遗传育种上的应用
1、分子水平上选择目的性状
RFLP图本身对植物育种并没有直接的用处，只有当它与经典标记即原已定位的基因结合起来 才有用，当确定哪一个RFLP标记与目的性状表现协同分离，即目的基因与RFLP的连锁，使得 对期望基因重组型的选择容易进行，在分子水平上选择目的性状，不受环境条件遗传背景的 影响，RFLP连锁图谱为育种者们提供了一种高效选择手段，在马铃薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麦类作物上已相继出现RFLP作图的有关报道。育种者们只要选择 了与目的基因紧密连锁的一个或多个RFLP标记，也就选择了目的基因，因为与目的基因连锁 的RFLP标记是易于检测的。这种间接对那些直接选择有困难或过于费时、费力的性状以及在 分离群体中隐性性状的选择特别有效。在番茄中已鉴定的与RFLP标记连锁的基因，有番茄花 叶病毒、镰刀菌、细菌斑和根结线虫的抗性基因及控制植株生长习性(SP)和果实成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮杆花叶病毒抗性基因、莴苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP标记。
3、进行品种或品系遗传纯度的测定
对整个基因组中许多连锁位点上RFLP图谱的了解，则可对某一品种或纯系进行基因型图解， 以代表这一品系具有品种特异性，因此基因组中一些微小变异可以从RFLP图谱的改变监测出 来；所以RFLP图谱技术还可用于种子专利登记中，解决侵权纠纷，在欧洲已为一些商业育种 者用来保护自己的品种权益。
5、建立不相容的作物间的遗传关系，进行作物间基因组同源性的测定
在分类学上，一些性不相容的作物有一定的亲缘关系，如甘兰、萝卜、 白菜都属芸苔属， 玉米、高粱都属禾本科，马铃薯、番茄、辣椒等属茄科，但对它们基因染色体组的同源性所 知甚少，如果染色体成分的基因顺序在亲缘种间是高度保守的，则有可能通过体细胞杂交或 外缘DNA导入等手段，替换单个染色体或染色体片段，将作物的优良性状及那些在一个种的 正常杂交范围内无法得到的基因组合到一起。利用同一套探针进行RFLP作图，已测定了番茄 、马铃薯和辣椒的染色体组成和基因顺序的保守程度，建立三者之间的比较连锁图谱，通过 比较番茄和马铃薯间高度连锁保守，染色体有部分同源性，有可能进行染色体或片段交换， 而辣椒同源性差。
五、问题与展望
RFLP技术结合到常规育种程序中，使人们能快速精确地获得、转移和组合基因。由于RFLP对 育种方法学的直接影响，RFLP探计的应用将可能作为最先列入商业或政府育种计划的生物技 术之一，也将成为对农业生产影响的第一批生物技术。但RFLP图谱的可利用程度依赖于其饱 和水平，即片段数目和这些片段在染色组分布水平与所表现出的多态性水平，并且还要求某 一多态性特征与某一期望的表现型相连锁。RFLP作图计划的目标之一是建立“饱和图”，所 有染色体每隔10～20个交换单位(cM)就有RFLP标记，一个饱和图要包含150个左右间隔均匀 的标记，即必须用数以百计的探计作图，才有可能达饱和水平，故而这项技术费用昂贵及放 射性同位素标记存在问题，是目前RFLP技术普遍应用的局限性。但将来发展简便方法，用生 物素或酶标记的DNA探计，费用将会降低。
第二，大部分标记为共显性：表现RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因(其显性)。遵循孟德尔式遗传，因而RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。
第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。
2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。
一、基本原理
限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。
2、RFLP遗传标记与作物数量性状基因定位
在农作物中有许多经济性状都是由单个基因效应微小的多基因控制且易受环境影响的数量性 状，多年来对这类性状的遗传研究主要采用数量遗传学的方法，通过适当的试验设计和统计 模型估算出平均数、方差、协方差、遗传力、配合力等遗传参数．用这些参数描述群体的遗 传特征，对育种研究起了一定的指导作用，但对控制数量性状的基因数目、数量性状基因座 位(Quantitative Trait Loci简称QTL)在染色体上的位量，QTL各基因座位对数量性状的贡 献大小及其基因间关系等问题，则需RFLP检测技术来研究。目前用高密度RFLP图谱上的分子 标记作为重要数量性状，如产量、株高、果实及种子成分含量等QTL作图，可望推出控制数 量性状的多基因数目，确定QTL在染色体上的位置，测定单个基因的作用效应。应用分子标 记定位QTL的过程是首先检测、筛选亲本并构建遗传群体，构建分子标记连锁图，然后根据 统计模型及方法与QTL的连锁关系及QTL在染色体上的区域等，达到定位QTL之目的。近年来 ，应用RFLP标记在番茄、玉米、水稻等作物中的QTL定位研究取得了可喜的成果，如水稻稻 瘟 病抗性多基因定位，番茄果重、可溶性固体含量、pH值QTL定位研究，控制玉米成熟性的QTL 分析等。
第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。
2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：
第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子 机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象；
4、改良回交育种技术
有性杂交育种就是将具目的性状品种与待改良的品种进行杂交，其分离后代的染色体由双亲 的染色体片段镶嵌而成，即带有所需的亲本性状，也带有不希望出现的亲本性状。回交育种 技术引入供体基因后，用以恢复亲本原有优良基因型的方法，通过多次回交选择或回交、自 交选择(目的基因为隐性)，就能得到遗传上与受体亲本相似，但加入了目的基因的植株。回 交育种局限性在于时间长，目的基因为主效、易检测，RFLP技术的出现可望克服回交育种的 局限，如欲转移的基因与RFLP标记紧密连锁，则在幼苗期，即性状尚未表达之前就可检测目 的基因是否存在，并且利用RFLP技术，回交育种也可针对于数量性状基因进行。
第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA浓度不能太高；
第四，电泳时要用低压电泳；
第五，杂交前探针必须充分变性；
第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件；
二、RFLP技术的基本步骤
这一技术主要包括三大步骤：
1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。
三、RFLP技术的优点及注意的问题
1、RFLP技术的优点
第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的的时间。
四、RFLP在作物遗传育种上的应用
1、分子水平上选择目的性状
RFLP图本身对植物育种并没有直接的用处，只有当它与经典标记即原已定位的基因结合起来 才有用，当确定哪一个RFLP标记与目的性状表现协同分离，即目的基因与RFLP的连锁，使得 对期望基因重组型的选择容易进行，在分子水平上选择目的性状，不受环境条件遗传背景的 影响，RFLP连锁图谱为育种者们提供了一种高效选择手段，在马铃薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麦类作物上已相继出现RFLP作图的有关报道。育种者们只要选择 了与目的基因紧密连锁的一个或多个RFLP标记，也就选择了目的基因，因为与目的基因连锁 的RFLP标记是易于检测的。这种间接对那些直接选择有困难或过于费时、费力的性状以及在 分离群体中隐性性状的选择特别有效。在番茄中已鉴定的与RFLP标记连锁的基因，有番茄花 叶病毒、镰刀菌、细菌斑和根结线虫的抗性基因及控制植株生长习性(SP)和果实成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮杆花叶病毒抗性基因、莴苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP标记。
3、进行品种或品系遗传纯度的测定
对整个基因组中许多连锁位点上RFLP图谱的了解，则可对某一品种或纯系进行基因型图解， 以代表这一品系具有品种特异性，因此基因组中一些微小变异可以从RFLP图谱的改变监测出 来；所以RFLP图谱技术还可用于种子专利登记中，解决侵权纠纷，在欧洲已为一些商业育种 者用来保护自己的品种权益。
5、建立不相容的作物间的遗传关系，进行作物间基因组同源性的测定
在分类学上，一些性不相容的作物有一定的亲缘关系，如甘兰、萝卜、 白菜都属芸苔属， 玉米、高粱都属禾本科，马铃薯、番茄、辣椒等属茄科，但对它们基因染色体组的同源性所 知甚少，如果染色体成分的基因顺序在亲缘种间是高度保守的，则有可能通过体细胞杂交或 外缘DNA导入等手段，替换单个染色体或染色体片段，将作物的优良性状及那些在一个种的 正常杂交范围内无法得到的基因组合到一起。利用同一套探针进行RFLP作图，已测定了番茄 、马铃薯和辣椒的染色体组成和基因顺序的保守程度，建立三者之间的比较连锁图谱，通过 比较番茄和马铃薯间高度连锁保守，染色体有部分同源性，有可能进行染色体或片段交换， 而辣椒同源性差。
五、问题与展望
RFLP技术结合到常规育种程序中，使人们能快速精确地获得、转移和组合基因。由于RFLP对 育种方法学的直接影响，RFLP探计的应用将可能作为最先列入商业或政府育种计划的生物技 术之一，也将成为对农业生产影响的第一批生物技术。但RFLP图谱的可利用程度依赖于其饱 和水平，即片段数目和这些片段在染色组分布水平与所表现出的多态性水平，并且还要求某 一多态性特征与某一期望的表现型相连锁。RFLP作图计划的目标之一是建立“饱和图”，所 有染色体每隔10～20个交换单位(cM)就有RFLP标记，一个饱和图要包含150个左右间隔均匀 的标记，即必须用数以百计的探计作图，才有可能达饱和水平，故而这项技术费用昂贵及放 射性同位素标记存在问题，是目前RFLP技术普遍应用的局限性。但将来发展简便方法，用生 物素或酶标记的DNA探计，费用将会降低。
第二，大部分标记为共显性：表现RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因(其显性)。遵循孟德尔式遗传，因而RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。
第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。
2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。
一、基本原理
限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。
2、RFLP遗传标记与作物数量性状基因定位
在农作物中有许多经济性状都是由单个基因效应微小的多基因控制且易受环境影响的数量性 状，多年来对这类性状的遗传研究主要采用数量遗传学的方法，通过适当的试验设计和统计 模型估算出平均数、方差、协方差、遗传力、配合力等遗传参数．用这些参数描述群体的遗 传特征，对育种研究起了一定的指导作用，但对控制数量性状的基因数目、数量性状基因座 位(Quantitative Trait Loci简称QTL)在染色体上的位量，QTL各基因座位对数量性状的贡 献大小及其基因间关系等问题，则需RFLP检测技术来研究。目前用高密度RFLP图谱上的分子 标记作为重要数量性状，如产量、株高、果实及种子成分含量等QTL作图，可望推出控制数 量性状的多基因数目，确定QTL在染色体上的位置，测定单个基因的作用效应。应用分子标 记定位QTL的过程是首先检测、筛选亲本并构建遗传群体，构建分子标记连锁图，然后根据 统计模型及方法与QTL的连锁关系及QTL在染色体上的区域等，达到定位QTL之目的。近年来 ，应用RFLP标记在番茄、玉米、水稻等作物中的QTL定位研究取得了可喜的成果，如水稻稻 瘟 病抗性多基因定位，番茄果重、可溶性固体含量、pH值QTL定位研究，控制玉米成熟性的QTL 分析等。
第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。
2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：
第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子 机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象；
4、改良回交育种技术
有性杂交育种就是将具目的性状品种与待改良的品种进行杂交，其分离后代的染色体由双亲 的染色体片段镶嵌而成，即带有所需的亲本性状，也带有不希望出现的亲本性状。回交育种 技术引入供体基因后，用以恢复亲本原有优良基因型的方法，通过多次回交选择或回交、自 交选择(目的基因为隐性)，就能得到遗传上与受体亲本相似，但加入了目的基因的植株。回 交育种局限性在于时间长，目的基因为主效、易检测，RFLP技术的出现可望克服回交育种的 局限，如欲转移的基因与RFLP标记紧密连锁，则在幼苗期，即性状尚未表达之前就可检测目 的基因是否存在，并且利用RFLP技术，回交育种也可针对于数量性状基因进行。
第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA浓度不能太高；
第四，电泳时要用低压电泳；
第五，杂交前探针必须充分变性；
第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件；
二、RFLP技术的基本步骤
这一技术主要包括三大步骤：
1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。