RFLP限制性内切酶片段长度多态性
RFLP限制性片段长度多态性
Your company slogan
RFLP中应用的限制性内切酶
LOGO
限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，丌同的内切酶可辨认并作用亍特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
Your company slogan
RPLF技术的原理
LOGO
利用特定的限制性内切酶识别并切割丌同生物个体的基因 组DNA，得到大小丌等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上丌同酶切位点的分布 情冴。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成丌同带，然后不兊隆 DNA探针迚行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由亍丌同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切収生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
Your company slogan
数据分析
LOGO
（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中叏出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
一、RFLP概念
限制性内切酶片段长度多态性）作为第一代分子 生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学 科研究中。 所谓RFLP, 是指用限制性内切酶切割不同个体基因 组DNA 后, 含同源序列的酶切片段在长度上的差异。 20 世纪70年代, 限制性内切酶的发现使DNA 变异 研究成为可能, 1974年RFLP 作为遗传工具由 Grodjicker 创立, 1980 年由Botstein 再次提出, 并由 Soller 和Beckman( 1983) 最先应用于品种鉴别和品 系纯度的测定, 这是第一个被应用于遗传研究的 DNA 分子标记技术。
1、染色体原位杂交
一种基于Southern 杂交的分子标记技术。它 利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体 DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA。
可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自 显影显示杂交信号。 也可以采用非放射性大分子如生物素、地 高辛等标记特异核酸片段, 杂交信号经酶联 显色或荧光显色得以显示。
四、R F L P 技术的基本步骤
1、靶D N A 的准备。先将基因组D N A 抽提出来, 选用合
适的限制性核酸内切酶酶解基因组D N A , 将酶解出来的 具有各种长度的D N A 片段在琼脂搪凝胶电泳分离, 使其 按片段的长短排列, 将D N A 片段变性后转移至硝酸纤维 膜或尼龙膜上,称印迹(So u t he r n b l o t ) 转移, 并在8 0 ℃ 烘烤或用长波紫外线照射, 将D N A 固定在膜上。 2、核酸探针的标记。将准备作为探针的D N A片段纯化 (这些D N A 片段可以是基因组D N A 的一个片段, 或是c D N A , 或是人工合成的寡核昔酸) , 用放射性元素(如Q 一32 p ) 或非放射性元素(如n ig 一d U T P 等) 标记, 经纯化后再 用。 3 、杂交显示。将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜 上的单链核酸杂交, 洗膜去除未杂交的标记探针后, 进行 放射自显影或加人酶的底物进行显色反应, 再对显示出来 的谱带进行分析。
限制性内切酶片段长度多态性RestrictionFragmentLength
一 基本原理
RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP 是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种 差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、 重排或点突变所引起的。
限制性核酸内切酶（restriction end nuclease） 能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之 切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识 别序列。 在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性 核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生 不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的 DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以 反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。 这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段 长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同， 因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为 RFLP）技术。
二 RFLP技术的基本步骤
这一技术主要包括三大步骤：
1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出 来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组 DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段 在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列， 将DNA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上， 称印迹（Southern b1ot）转移，并在80℃烘 烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。
if both parents were heterozygous, they could have children with any of the three genotypes, though heterozygous children would be twice as likely as either of the homozygous genotypes.
RFLP 检测内皮一氧化氮合酶基因多态性
RFLP检测内皮一氧化氮合酶基因多态性一、实验背景PCR-RFPLDNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
RFLP（限制片段长度多态性）已被广泛基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同个体基因组的限制性内切酶的酶切位点发生改变，或酶切位点之间发生碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化也可以通过特定探针杂交进行检测，从而可以比较不同个体DNA水平的差异（即多态性）。
内皮一氧化氮合酶基因多态性与高血压一氧化氮合酶（NOS）是一种催化小分子信息化合物，一氧化氮生成的酶广泛参与免疫调节、神经传递、血压生理调控和血小板凝聚的抑制等多种生理功能。
与高血压、糖尿病、肾病等多种疾病的发生密切相关。
NOS可以分为三型：神经元型、诱导型、内皮型。
内皮型一氧化氮合酶（NOS3，又称eNOS）基因在人类染色体上定位于7q35~7q36区域，跨度约21kb，含有26个外显子和25个内含子，相应的信使核糖核酸（mRNA）约4.1kb，翻译成含1203个氨基酸的蛋白产物。
近年来已知的NOS3的3个基因多态性位点与原发性高血压的关系。
1、位于第4内含子上的27bp数目可变的串联重复序列（VNTR），根据重复次数不同有两种等位基因，重复4次为a等位基因，重复5次为b等位基因。
2、位于第8外显子上，由于894位碱基G突变成T（G894T，即rs57135373），导致相应蛋白产物第298位上的谷氨酸被替换成天冬氨酸（Glu298Asp），突变前后的等位基因分别成为G、T等位基因。
3、位于5端侧翼区上786位碱基T突变成C（T786C），突变前后的等位基因分别为T、C等位基因。
G894T多态性1.与血管痉挛的关系:最近的研究显示带有G894T的NOS3基因转染细胞后可以分裂成100Kda和35Kda的两个片段，影响NOS3的功能导致NOS3合成减少或功能下降，NO减少，冠状动脉紧张性升高诱发冠状动脉痉挛。
基因工程题库版--名词解释
各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
RFLP,SNP标记
RFLP的操作流程
RFLP具有以下特点：
RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但 RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂， 不适于大规模的分子育种。 可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的， 也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是 由碱基突变或倒位、 还是由缺用
SNP标记技术，主要包括两个方面：SNP位点 的发现和SNP分型。 发现SNPs方法:包括直接测SNPs。 通常从待测定 的基因或ESTs提供的序列设计引物，扩增出目 的片段，对扩增产物进行双链测序。然后，还 要对所得序列进行排序并仔细鉴别真正的多态 性和由于测序误差而产生的差异。也可以通过 生物信息学相关软件查找预测SNP。
（三）分子信标技术 与Taqman技术相 似，分子信标技术也是在PCR反应体系种 加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过 仪器检测荧光值的变化，进行基因分型。 （四）焦磷酸测序法 焦磷酸测序法 是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依 赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列 分析技术，适用于已知SNP的序列验证及 基因分型。
优点：（1）SNP具有共显性，能获得的 标记数量多，易于实现高通量。 （2）SNP是基因组中最简单、最常见的 多态性形式，具有很高的遗传稳定性。 缺点:芯片设计成本高，由于DNA样品的 复杂性，有些SNP不能被捡起。
back
thank
you !
SNP标记
基于DNA芯片技术的分子标记技术 核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是美国学者 Lander E于1996年提出的第三代DNA遗 传标记。由于单个核苷酸改变而导致核酸 序列多态，即基因中的点突变。SNP 标 记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。 人类基因组大约每 1250 bp SNP 出现一 次，已有2000多个标记定位于人类染色 体，对人类基因组学研究具有重要意义。 检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。
T-RFLP
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制 性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常 是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限 于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不 等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度 的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同 波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样 品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差 异。
下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序， 用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周 能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个 同组样本 的图谱， 波峰大致 上是相同 的，这样 表明这两 个样本数 据是比较 可靠的。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越 引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术 得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很 大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异 ，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。 由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于 具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的 结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质 地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。
DNA鉴定方法
DNA鉴定方法DNA鉴定方法DNA鉴定是一种通过对DNA序列的比较分析，确定个体之间的亲缘关系或确认身份的方法。
DNA鉴定在刑侦、亲子鉴定、遗传病诊断等领域有广泛应用。
本文将介绍DNA鉴定的基本原理和常用方法。
DNA鉴定的原理在于人类DNA的独特性和遗传性。
DNA是一种包含遗传信息的分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们按照一定的规则排列成两条螺旋状的链。
每个人的DNA序列都是独一无二的，除了一些双胞胎之外。
鉴定方法主要利用DNA的这种独特性，通过比较个体的DNA序列，确定是否具有亲缘关系或是否为同一人。
常用的DNA鉴定方法包括：1. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：RFLP分析是DNA鉴定的经典方法之一。
它通过利用限制性内切酶将DNA切割成多个不同长度的片段，然后使用凝胶电泳将这些片段进行分离，并利用射入探针的杂交方法进行检测。
不同个体之间的DNA序列差异会导致不同的片段长度，从而可以通过比较片段长度来确定个体之间的亲缘关系。
2. PCR（聚合酶链式反应）分析：PCR是一种快速有效的DNA复制技术，可以从微量DNA中扩增出足够数量的DNA片段用于分析。
PCR分析常用于亲子鉴定、法医学和遗传病诊断。
PCR分析通常配合其他技术如序列分析、飞行时间质谱和DNA芯片等来进行。
3. STR（短串联重复）分析：STR分析是目前最常用的DNA 鉴定方法之一。
STR序列是由2-6个碱基重复单元组成的，不同个体之间的STR序列重复单元数目存在差异。
STR分析通过PCR扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分离，并通过比较STR重复单元数目来鉴定个体之间的亲缘关系或身份。
DNA鉴定的过程包括取样、提取DNA、扩增DNA片段、分离和检测。
取样可以采用血液、口腔拭子、毛发等样品。
提取DNA需要将样品中的DNA从细胞核和细胞器中分离出来。
DNA扩增通过PCR技术，可以在短时间内从微量DNA样品中复制出大量DNA片段。
几种常用的分子标记.
RAPD标记的特点： 1.RAPD标记引物扩增产物所扩增的DNA区段是事
先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标 记技术可用于对任何未知基因组的研究。
2.RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传， 不能区分显性纯合和杂合的基因型，因而提供的信息 量不完整。
0.2kb 0.5kb
0.2kb 0.5kb
0.3kb
0.3kb ×
品系1 品系2
0.5kb 0.3kb 0.2kb
S451对DH962×冀棉5号F2群体扩增图
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可 用于构建基因组指纹图谱。
1.品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或 种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以 分析混合基因组样品等。
谢谢观看
Thank you for watching
头 （c）寡核苷酸接头与限制片段连接 （d）用选择性引物进行PCR扩 增
种子生产与经营专业教学资源库
四、简单序列重复（SSR）标记
又称微卫星，是一类由几个（一般2-6个）核苷酸为 重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。如 (CA)n、(AT)n、(GGC)n等。
微卫星DNA的简单序列的重复次数在同一物种的不同 品种或不同个体中存在较大的差异，即微卫星座位上存在 丰富的等位基因。如在水稻中，RFLP座位的等位基因数 为2-4个，而SSR的等位基因数为2-25个。
种子生产与经营专业教学资源库
三、扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP标记，是结合RFLP和PCR的优点发明的一种 DNA指纹技术。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩 增来检测DNA酶切片段长度的多态性 。
生物分子检测名词解释
Affinity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。
Agglutination：凝集反应，细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物的过程。
Avidity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。
Blocking：封闭，是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
Blotting：印迹，就是将电泳分离后的琼脂糖凝胶中核酸片段转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上的过程，转移后核酸片段保持相对位置不变。
Coating：包被，即将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。
ELISA：酶联免疫吸附测定是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。
Gene Chip：基因芯片又称DNA 芯片、生物芯片，在一张固相支持介质上同时固定成百上千个核酸片段，再将扩增的核酸样品与之杂交，反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的总信息，是集成化的核酸分子杂交技术。
HA：血凝素，是由3 条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，其C 末端有一疏水区插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是与病毒囊膜的结合部位。
HI：血凝抑制，先将可溶性抗原与特异性抑制血球凝集的血清(抗体) 混合，隔一定时间后加入“致敏红细胞红”(细胞表面吸附可溶性抗原)，则不再与相应抗体发生凝集现象的过程。
限制性片段长度多态性实验(RFLP)
实验限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：10xM buffer 1 μLddH2O 5.5 μLHind Ⅲ0.5 μLPCR产物 3 μL37℃水浴消化2h ，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTTTTCGA ↑A ABAA BB 2000 7505002501000100。
限制性片段长度多态性 RFLP课件
Your company slogan
LOGO
Your company slogan
LOGO
Your company slogan
三种限制性内切酶
LOGO
I型酶
II型酶
如酶的识别位点上 两条DNA链均未甲 基化，就行使内切酶 功能，但切割点不在 识别位点，而在1kb （不少于400bp）或nk b(最多7kb)处随机切割.
限制性片段长度多态性 RFLP
限制性片段长度多态性RFLP
1 RFLP技术的简介 2 RFLP中应用的限制性内切酶 3 RFLP的实验步骤 4 RFLP技术的应用
LOGO
Your company slogan
分子标记的历史
LOGO
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，
Your company slogan
RPLF技术的简介
LOGO
个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有 重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异 成为DNA多态性。
假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。 这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与 正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现 不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。
Your company slogan
RFLP的类型
LOGO
1.点的多态性
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有
rflp
【仪器设备】
恒温箱
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20?l和20～200?l）
0.5ml Eppendorf 管
紫外线观察装置及照相设备
3 操作程序
将纯化的并经自然干燥的PCR产物（1?g）加17?l TE缓冲液或无菌水（内含RNase A），使DNA完全溶解。在冰上用微量移液器依次加入酶解缓冲液2?l和限制性内切酶3U（1?l）。将清洁、干燥、灭菌的Eppendorf管编号。加样后，小心混匀，置于37℃水浴中（一般情况），酶解2～3h，然后向每个小管中分别加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于4℃中贮存备用。
2．促进异源种质的转移和利用
原始种和野生种含有大量的遗传变异，它们是品种改良的目标基因的来源。但是，野生种和栽培种杂交困难，且杂种常部分或全部不育，即使获得可育杂种，也难以保证目标性状基因已成功地转移到了栽培品种中，从而限制了野生种的利用。Nilliams等（1990）利用体பைடு நூலகம்胞融合的RFLP标记相结合的方法，开辟了利用RFLP从野生和原始种质中获得有用基因的新领域。
DNA多态性根据其产生的方式基本上有两种：一是碱基对突变类型，即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换（转换或颠换），使原有切点消失或产生新的切点；另一类是结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的；引起这种变化的原因包括两个方面：一是DNA顺序发生了突变，如缺失、倒位或插入等；二是近年来发现的高变区。高变区由多个串联重复顺序组成，一般位于基因附近。不同个体高变区的串联重复顺序的拷贝数相差悬殊，高变区长度变化很大，从而使高变区两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随高变区而发生相对位移。对于DNA的检测，用限制性内切酶种类越多，对基因结构的了解就越精细。在实际的操作过程中碰到的最大问题就是高等植物的染色体太大太复杂了，如果用限制性内切酶降解，很难在琼脂糖凝胶上看到DNA片段的多态性，通常我们看到的都是弥散状的DNA（因为条带太多太密集了）。解决这一问题时人们自然想到了Southern杂交，将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜（或其他膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。
rflp标记的名词解释
rflp标记的名词解释RFLP是"Restriction Fragment Length Polymorphism"（限制性片段长度多态性）的缩写，是一种基因分型技术，用于研究DNA序列的差异性。
通过观察DNA片段的长度变化，RFLP可以帮助人们了解基因座在个体之间的多态性，从而提供了一种分子遗传分析的方法。
一、RFLP的原理RFLP技术基于DNA序列的变异，而DNA的变异表现为序列中的一处或多处核苷酸序列发生突变。
这些变异会导致限制性内切酶切割DNA序列时产生不同的片段长度。
通过将DNA进行限制性内切酶消化，再通过凝胶电泳技术分离DNA片段，并通过特定的探针杂交以检测特定的片段，就可以确定个体之间的差异。
二、RFLP技术的应用1. 生物学研究：RFLP技术被广泛应用于生物学研究中，特别是用于研究种群遗传学、亲子关系以及进化等方面。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以推测个体或群体之间的亲缘关系、种群的遗传多样性以及基因座的分布情况，为生物学研究提供了宝贵的遗传数据。
2. 遗传疾病检测：RFLP技术在遗传疾病的检测与诊断中也有重要的应用。
许多遗传疾病与特定的基因突变有关，通过分析这些突变引起的RFLP变异，可以确定某些疾病的患病风险。
例如，围绝经期乳腺癌与BRCA1基因的RFLP分型相关，通过进行RFLP分析，可以预测遗传性乳腺癌的风险。
三、RFLP的优缺点1. 优点：RFLP技术在技术成熟的同时，具有高度可靠性和准确性。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以得出有关个体间遗传关系、多态性以及基因特征等信息。
此外，RFLP技术还具有较高的灵敏度，能够检测到充分稀释的DNA样本。
2. 缺点：然而，RFLP技术也存在一些局限性。
首先，该技术要求大量的DNA 样本，通常需要提取和纯化大量高质量的DNA，这在某些情况下可能是困难的。
此外，从样本收集到结果分析需要较长的时间，限制了该技术应用于实时或紧急情况的能力。
RFLP,RAPD,ALFP,SSR的原理及示意图
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离3.AFLP原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
SNP标记
位于基因组内的SNP可以分为2种形式: 一是基因编码区的突变 ,主要分布于基因编码区 内(coding region) ,故又称其为cSNP; 二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异 , 又分为基因周边SNP (peripheral SNP, pSNP) 及基因间SNP ( intronic SNP, iSNP) .研究表明 基因周边SNP频率比基因编码区SNP频率高。
RFLP的应用
3.遗传多态性分析 运用RFLP技术可以尽 可能多地保存那些在已知位点上有异态的 品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对 DNA序列自然变异的直接检测，只需选 择 适当的限制性内切酶或DNA探针作分 子标记，因而对植物不同种属或杂种后的 的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较 高的灵活性和灵敏性。因而能较好地应用 于细胞质遗传的研究。 ←
RFLP， SNP标标记原理及Fra bibliotek用——分子标记 法
四、 RFLP标记
定义：RFLP即DNA限制性片段长度多态性， 它是指应用特定的核酸限制内切酶切割有关的 DNA分子所产生出来的DNA片段在长度上的 变化。对于每一个DNA/限制性内切酶组合来 说，所产生的片段是特异性的，它能作为某一 DNA（或含这种DNA的产物）所特有的“指 纹”（即片段差异的多态性）。 基本原理：RFLP标记是由于不同基因型之中内 切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变 ,利用 限制内切酶消化基因组DNA 时 , 会产生大小
RFLP,EST,RAPD,AFLP,微卫星SSR,线粒体DNA标记
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：不同个体DNA的提取PCR扩增目的片断酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：选择随机引物DNA的提取PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
三、RFLP技术的优点及注意的问题
1、RFLP技术的优点
第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的的时间。
四、RFLP在作物遗传育种上的应用
1、分子水平上选择目的性状
RFLP图本身对植物育种并没有直接的用处，只有当它与经典标记即原已定位的基因结合起来 才有用，当确定哪一个RFLP标记与目的性状表现协同分离，即目的基因与RFLP的连锁，使得 对期望基因重组型的选择容易进行，在分子水平上选择目的性状，不受环境条件遗传背景的 影响，RFLP连锁图谱为育种者们提供了一种高效选择手段，在马铃薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麦类作物上已相继出现RFLP作图的有关报道。育种者们只要选择 了与目的基因紧密连锁的一个或多个RFLP标记，也就选择了目的基因，因为与目的基因连锁 的RFLP标记是易于检测的。这种间接对那些直接选择有困难或过于费时、费力的性状以及在 分离群体中隐性性状的选择特别有效。在番茄中已鉴定的与RFLP标记连锁的基因，有番茄花 叶病毒、镰刀菌、细菌斑和根结线虫的抗性基因及控制植株生长习性(SP)和果实成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮杆花叶病毒抗性基因、莴苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP标记。
3、进行品种或品系遗传纯度的测定
对整个基因组中许多连锁位点上RFLP图谱的了解，则可对某一品种或纯系进行基因型图解， 以代表这一品系具有品种特异性，因此基因组中一些微小变异可以从RFLP图谱的改变监测出 来；所以RFLP图谱技术还可用于种子专利登记中，解决侵权纠纷，在欧洲已为一些商业育种 者用来保护自己的品种权益。
5、建立不相容的作物间的遗传关系，进行作物间基因组同源性的测定
在分类学上，一些性不相容的作物有一定的亲缘关系，如甘兰、萝卜、 白菜都属芸苔属， 玉米、高粱都属禾本科，马铃薯、番茄、辣椒等属茄科，但对它们基因染色体组的同源性所 知甚少，如果染色体成分的基因顺序在亲缘种间是高度保守的，则有可能通过体细胞杂交或 外缘DNA导入等手段，替换单个染色体或染色体片段，将作物的优良性状及那些在一个种的 正常杂交范围内无法得到的基因组合到一起。利用同一套探针进行RFLP作图，已测定了番茄 、马铃薯和辣椒的染色体组成和基因顺序的保守程度，建立三者之间的比较连锁图谱，通过 比较番茄和马铃薯间高度连锁保守，染色体有部分同源性，有可能进行染色体或片段交换， 而辣椒同源性差。
五、问题与展望
RFLP技术结合到常规育种程序中，使人们能快速精确地获得、转移和组合基因。由于RFLP对 育种方法学的直接影响，RFLP探计的应用将可能作为最先列入商业或政府育种计划的生物技 术之一，也将成为对农业生产影响的第一批生物技术。但RFLP图谱的可利用程度依赖于其饱 和水平，即片段数目和这些片段在染色组分布水平与所表现出的多态性水平，并且还要求某 一多态性特征与某一期望的表现型相连锁。RFLP作图计划的目标之一是建立“饱和图”，所 有染色体每隔10～20个交换单位(cM)就有RFLP标记，一个饱和图要包含150个左右间隔均匀 的标记，即必须用数以百计的探计作图，才有可能达饱和水平，故而这项技术费用昂贵及放 射性同位素标记存在问题，是目前RFLP技术普遍应用的局限性。但将来发展简便方法，用生 物素或酶标记的DNA探计，费用将会降低。
第二，大部分标记为共显性：表现RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因(其显性)。遵循孟德尔式遗传，因而RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。
第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。
2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。
一、基本原理
限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。
2、RFLP遗传标记与作物数量性状基因定位
在农作物中有许多经济性状都是由单个基因效应微小的多基因控制且易受环境影响的数量性 状，多年来对这类性状的遗传研究主要采用数量遗传学的方法，通过适当的试验设计和统计 模型估算出平均数、方差、协方差、遗传力、配合力等遗传参数．用这些参数描述群体的遗 传特征，对育种研究起了一定的指导作用，但对控制数量性状的基因数目、数量性状基因座 位(Quantitative Trait Loci简称QTL)在染色体上的位量，QTL各基因座位对数量性状的贡 献大小及其基因间关系等问题，则需RFLP检测技术来研究。目前用高密度RFLP图谱上的分子 标记作为重要数量性状，如产量、株高、果实及种子成分含量等QTL作图，可望推出控制数 量性状的多基因数目，确定QTL在染色体上的位置，测定单个基因的作用效应。应用分子标 记定位QTL的过程是首先检测、筛选亲本并构建遗传群体，构建分子标记连锁图，然后根据 统计模型及方法与QTL的连锁关系及QTL在染色体上的区域等，达到定位QTL之目的。近年来 ，应用RFLP标记在番茄、玉米、水稻等作物中的QTL定位研究取得了可喜的成果，如水稻稻 瘟 病抗性多基因定位，番茄果重、可溶性固体含量、pH值QTL定位研究，控制玉米成熟性的QTL 分析等。
第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。
2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意：
第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子 机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象；
4、改良回交育种技术
有性杂交育种就是将具目的性状品种与待改良的品种进行杂交，其分离后代的染色体由双亲 的染色体片段镶嵌而成，即带有所需的亲本性状，也带有不希望出现的亲本性状。回交育种 技术引入供体基因后，用以恢复亲本原有优良基因型的方法，通过多次回交选择或回交、自 交选择(目的基因为隐性)，就能得到遗传上与受体亲本相似，但加入了目的基因的植株。回 交育种局限性在于时间长，目的基因为主效、易检测，RFLP技术的出现可望克服回交育种的 局限，如欲转移的基因与RFLP标记紧密连锁，则在幼苗期，即性状尚未表达之前就可检测目 的基因是否存在，并且利用RFLP技术，回交育种也可针对于数量性状基因进行。
第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA浓度不能太高；
第四，电泳时要用低压电泳；
第五，杂交前探针必须充分变性；
第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件；
二、RFLP技术的基本步骤
这一技术主要包括三大步骤：
1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。