扩增片段长度多态性
第二节扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlength
四种dNTP必须浓度相等
5. Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系，一般常用 1.5mmol/L终浓度。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） -扩增10Kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增。 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4.循环次数
主要取决于模版DNA的浓度。 一般为25-35次。 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。
5.PCR技术的特点
•High sensitivity---灵敏度高 •High specificity---特异性高 •Template DNA purity and integrity
第二节 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length
polymporphism, Amp-FLP）
一.扩增片段长度多态性概述 二.聚合酶链式反应
三.常染色体STR分型
四.Y染色体STR分型
第三节 扩增片段长度多态性
（amplified fragment length polymporphism, Amp-FLP）
＊二.PCR反应体系
• Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase )
• 引物(primer) • dNTP(A、T、C、G) • 模板(template) • Mg2+（PCR buffer）
DNA分子标记技术的研究与应用
DNA分子标记技术的研究与应用一、本文概述本文旨在对DNA分子标记技术的研究与应用进行全面的概述。
DNA分子标记技术作为现代分子生物学领域的一项重要工具，已经在生物学研究、遗传育种、疾病诊断等多个领域展现出广泛的应用前景。
本文首先介绍了DNA分子标记技术的基本概念、发展历程以及主要类型，包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和单核苷酸多态性（SNP）等。
接着，文章详细阐述了这些技术在不同领域中的具体应用，包括基因克隆、基因定位、遗传图谱构建、物种亲缘关系分析、基因表达和调控研究等。
本文还讨论了DNA分子标记技术在实践应用中面临的挑战和未来发展趋势，如高通量测序技术的结合、大数据分析的利用以及生物信息学的进一步发展等。
通过本文的综述，旨在为相关领域的研究人员和技术人员提供一个全面、深入的了解DNA分子标记技术的平台，以促进该技术的进一步发展和应用。
二、DNA分子标记技术的基本原理与类型DNA分子标记技术是一种直接以DNA多态性为基础的遗传标记技术，其基本原理在于利用DNA分子在基因组中存在的丰富的多态性，通过特定的技术手段将这些多态性转化为可识别的遗传信息，从而实现对生物个体或群体的遗传差异进行精确分析。
这种技术以其高度的准确性、稳定性和多态性，在生物学研究、遗传育种、种质鉴定、基因定位、分子育种、疾病诊断等领域中得到了广泛应用。
基于DNA-DNA杂交的分子标记技术：这类技术主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）和DNA指纹技术。
它们通过比较不同个体或群体间DNA片段的杂交信号差异，揭示出基因组中的多态性。
这类标记具有稳定性高、共显性遗传等特点，但操作复杂、成本较高。
基于PCR的分子标记技术：随着聚合酶链式反应（PCR）技术的出现和发展，基于PCR的分子标记技术应运而生。
这类技术包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和序列特征化扩增区域（SCAR）等。
第五章分子标记技术原理与应用
AFLP标记的基本原理是基于PCR技术扩增基因 组DNA限制性片段，基因组 DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到DNA片段的末端，接 头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结 合位点。限制性片段用两种 酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用 切割酶。
分子标记的应用
获得与目标性状连锁的分子标记
分子标记辅助育种的经典例子
美国科学家将分子选择应用在玉米杂种优势遗传改良上，经过改良的B73 改良的Mo17的组合比原始的B73 Mo17组合和一个高产推广组合 Pioneer hybrid 3165皆增产10%以上（Stuber and Sisco 1991; Stuber et al. 1995）。 通过分子标记技术将3个抗稻瘟病基因（Pi-2、Pi-1和Pi-4）在水稻第6、 11和12号染色体上进行定位，然后利用连锁标记将这3个抗性基因聚合起 来。基因聚合试验从3个分别带有Pi-2、Pi-1和Pi-4基因的近等基因系 C101LAC、C101A51和C101PKT出发，已成功地获得聚合了这3个抗稻瘟病 基因的植株，它们可以作为供体亲本在育种中加以利用，可同时提供数 个抗性基因。 （Zheng et al. 1995）
一、限制性片段长度多态性技 术(RFLP)
限制性片段长度多态性技术(RFLP)是用已知的 限制性内切酶消化目标 DNA，电泳印迹，再用DNA探针杂交并放射自 显影，从而得到与探针同源 的DNA序列酶切后在长度上的差异。 RFLP标记在正常的分离群体中都呈典型的孟德 尔式遗传。PFLP的结果稳 定，在作物基因图谱构建和QTL基因定位分析 上使用较多。
三、简单重复序列SSR
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
利用扩增片段长度多态性分析鉴别炭疽和蜡样芽孢杆菌
Ｆｒ ｇ ｅ ｎｇ ｈ ａ ｍ ｎｔ Ｌｅ ｔ Ｐｏｙ ｏ ｐｈ ｓ ｌ ｍ ｒ ｉｍ Ａｎａ ｙ ｉ ｌ ｓｓ
Ｚ Ｏ Ｕ 一 ｉ ，Ｌ ａ － ｅ Ａ Ｘ ｅ Ｌａ ， ｕ ，ＤＵ Ｎ Ｑ ｎ Ｔｎ ＩＹ ｎ Ｗ ｉ Ｎ ｕ — ｉｎ ＨＥ Ｊ ｎ ｇ ，Ｈ ｔ ｒ ｏ ａｈ ｇ ｎ ａ ｄ Ｂｉｓ ｃ ｒ ｙ ｎ ｔ ｕｅ ｏ ｃ ｏ ｉｌ ｇ ｎ ｉ ｅ ｏ ｏ ｙ ｙ ａ ｏ ａ ｏｙ ｆ Ｐ ｔ ｏ ｅ ｎ ｏ ｅ ｕ ｉ ，Ｉ ｓｉ ｔ ｆ Ｍｉｒ ｂ ｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅｐ ｄ ｍｉｌ ｇ ，Ａ ａ ｅ ｆ Ｍｉ ｔ ｒ ｔ ｔ ｃ ｄ ｍｙ ｏ ｌ ａ ｉｙ
Ｔ ｅ ａ ｌｓ ｅｅ ｎ ｌｚｄ ｎ ｎ ｈ ｓ ｍｐ ｅ ｗ ｒ ａ ａ ｙ ｅ ｏ ａ ＡＢＩ ＲＩ Ｍ ３ ０ ａ ｄ ｈ ＡＦ Ｐ ｒｆ ｅ ｗ ｒ ａ ａ ｙ ｅ ｕ ｉ ｇ Ｐ Ｓ ０ ｎ ｔ ｅ １ Ｌ ｐ ｏ ｌ ｓ ｅ ｅ ｎ ｌ ｚ ｄ ｓｎ Ｇｅ ｅ ｃ ｎ ｎ ｉ ｎ Ｓ ａ ａ ｄ
研 究报 告
利 用 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 分 析 鉴 别 炭 疽 和 蜡 样 芽 孢 杆 菌
左庭 婷 ， 李岩 伟 ， 雪莲 ， 韩 何君 ， 青 端
军 事 医学 科 学 院 微 生物 流 行 病 研 究 所 ， 原 微 生物 生 物 安 全 国家 重 点 实验 室 ， 京 １０ ７ 病 北 ００ １ ［ 要 】 目的 ： 用 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 （ Ｆ Ｐ 分 析 建 立 鉴 别 炭 疽 芽 孢 杆 菌 和 蜡 样 芽 孢 杆 菌 的分 子 生 物 学 方 法 。 摘 利 ＡＬ）
分子生态学复习资料汇总
分子生态学名词解释等位酶：（Allozyme）同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式。
突变：Genic mutation：基因突交是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。
从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
替换：即一种核苷酸被另一种核苷酸所取代。
•碱基替换有两种类型：转换是发生在嘌呤之间(A和G)或密啶之间(C和T）的变换;颠换则指嘌呤和嘧啶的变换。
•转换比颠换更频繁。
PCR：（聚合酶链式反应）在生物体外，利用一小段DNA作为模板，在DNA聚合酶的作用下，将材料dNTPs复制成跟模板互补的DNA链。
PCR每个循环可分为三步：DNA变性、引物退火、新合成序列的延伸。
单亲遗传( uniparental inheritance):基因和遗传因子仅遗传自一个亲本。
该术语最常用于描述线粒体和质体基因组的遗传（包括叶绿体基因组cpDNA）,以及有性繁殖生物中一些性染色体的遗传。
双亲遗传( biparental inheritance):基因与遗传因子遗传自两个亲本;仅适用于有性繁殖生物。
共显性标记：( co-dominant markers)可以区分杂合子与纯合子的分子标记。
显性标记:( dominant markers)难以区分纯合与杂合个体的分子标记。
限制性片段长度多态性（RFLP）：一种显性分子标记技术,用一种或多种限制性内切酶,对整个基因组或预选的DNA片段进行消化,从而生成多条DNA 片段。
所获得的带型取决于相应的DNA序列的变异水平,因为每一个体中DNA序列的变异会影响限制性酶切位点的数量。
单核苷酸多态：( single nucleotide polymorphism, SNP )由单核苷酸替换所导致的两条DNA序列间的一个变异。
微卫星(microsatellite)：一种DNA片段，由短的串联序列组成,通常以不超过5个碱基对的单元重复多次，如:在(AG)，代表的微卫星片段中,序列AG重复了10 次。
华南农业大学农学院《生物技术》复习题(附答案)
华南农业大学农学院《生物技术》复习题（附答案）一、有关名词遗传标记指可稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。
遗传多态性现代遗传学中是指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异。
形态标记简单性状的遗传（普通遗传学）细胞学标记染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）生化标记同工酶与电泳技术（生化遗传学）同工酶是指具有功能相同而结构及组成有差异的一类酶分子标记DNA标记，以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。
PCR 聚合酶链式反应。
是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。
RFLP 限制性片段长度多态性。
不同样品DNA经限制性酶酶解所产生片段大小的差异。
RAPD 随机扩增多态DNA。
是以一个寡聚脱氧核苷酸单链作随机引物(primer) ，通过PCR扩增基因组DNA，获得长度不同的多态性DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性。
SSR 简单序列重复。
是一类由几个核苷酸组成的基序（motif）为重复单元串联组成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置。
AFLP 扩增片段长度多态性。
是一种通过限制性内切酶酶切DNA产生不同长度DNA片段，再结合PCR 技术来检测DNA多态性的分子标记技术。
FM遗传图谱又称遗传连锁图谱。
指反映基因组内基因(遗传标记)在染色体上线性排列顺序及其相对位置的图谱。
分子遗传图谱不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。
作图群体是指用于遗传作图的符合孟德尔定律的分离群体。
RIL群体即重组近交系群体，是由重组近交系组成的分离群体，由F2经多代自交一粒传使后代基因组相对纯合的群体。
DH群体是由通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术获得单倍体植株再经染色体加倍而获得的加倍单倍体群体。
主效基因又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。
微效基因是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位QTL，其性状表现为连续的变异。
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA 分子标记技术大致可分为三类分子标记技术大致可分为三类: : : 第一类以第一类以Southern 杂交为核心杂交为核心, , , 其代表性技术为其代表性技术为RFLP ；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD 、SSR 、AFLP 、STS 、SRAP 、TRAP 等；第三类以DNA 序列序列((mRNA 或单核苷酸多态性单核苷酸多态性))为核心，其代表性技术为EST 标记、SNP 标记等。
理想的分子标记应达到以下的要求：标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；①具有高的多态性；①具有高的多态性；②共显性遗传；②共显性遗传；②共显性遗传；③能够明确辨别等③能够明确辨别等位基因；位基因；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；⑤选择中性⑤选择中性⑤选择中性((即无基因多效性即无基因多效性))；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。
目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。
其特点比较见表一。
其特点比较见表一。
1限制性内切酶片段长度态多态性性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）19741974年，年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA 突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA 片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )。
其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同同个体基因型中内切酶位点序列不同((可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA 时，会产生长度不同的DNA 酶切片段，通过凝胶电泳将通过凝胶电泳将 DNA 片段按各自的长度分开，通过Southern 印迹法，将这些大小不同的DNA 片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出即检出限制性片段长度多态性。
第四篇 基因的功能分析
一、前言
基因的含义：体现在三个方面
基因是突变单位，突变为进化 提供选择材料。 基因是结构单位，基因结构是 遗传的物质基础。
植物基因的功能分析
一、前言
基因的含义：体现在三个方面 基因是功能单位，基因功能的 发挥产生了生物性状。 基因功能的研究是分子生物学 研究的最主要目的之一。
什么是“基因的功能”？ 基因的功能是如何发挥作用？
遗传距离与物理距离之间的关系：
遗传距离与物理距离大致呈正相关，但 不能完全等同。
不同生物之间，遗传距离和物理距离的 相对大小是不同的。
人类： 1cM≈1000kb； 拟南芥： 1cM≈25kb； 番茄： 1cM≈510kb； 玉米： 1cM≈2140kb；
遗传距离与物理距离之间的关系：
同一生物中，遗传距离和物理距离的关 系也因标记物在不同性别的个体、同一 个体的不同染色体、同一染色体上的不 同位置而异。
4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是发展最早的 分子标记技术。
RFLP技术的原理是检测DNA在限制性 内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大 小。
4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
用不同生物杂交测出的遗传距离很可能 是不同的。
2、分子标记技术
1） 分子标记 (molecular marker)的概念
广义的分子标记是指可遗传的并可检测 的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括 种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶。
狭义的分子标记概念只是指DNA标记， 而这个界定现在被广泛采纳。
2、分子标记技术
PCR及相关技术
Pwo DNA聚合酶 从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的Pwo DNA聚合酶是在E.coli中表达后提取的产物。 1) 具有强的5’-3’聚合酶活性，兼有3’-5’外切酶活性。 2) 具有高的耐热性，100度下2小时后仍有一半的活性。 3) 可扩增5kb的片段，扩增DNA的准确度比Taq DNA聚合酶高约10倍。 4) 且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。 C.therm.聚合酶 1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在RT-PCR系统中催化逆转录反应。 2) 具有3’-5’外切酶活性，合成cDNA准确度比Tth DNA聚合酶高约2倍。
与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点： 一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响； 二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。
四、分子标记（DNA标记） 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：
Taq DNA聚合酶的特性
Tth DNA 聚合酶的特点： 从喜温性真菌中分离获得 1) 具有强的5’-3’聚合酶活性，缺3’-5’核酸外切酶活性。 2) 反应pH值为9，最适温度为75度。 3) 在Mn2+存在时，具有很强的反转录酶活性。 4) 当系统同时存在Mg2+时，反转录产生的cDNA在这种酶的作用下还可以进行PCR扩增。 故可用于RT-PCR。
英文缩写
英文名称
中文名称
RFLP
Restriction fragment length polymorphism
分子标记技术
（二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）
又称数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序列
多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出
二、基于PCR技术的分子标记
(一)随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD技术
RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。与其它标记相比,RAPD具有以下优点： 1）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析。2）操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖基因组的分析 3）不需制备探针、杂交等程序，成本较低。4）DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA
（二）特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）
）酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）将RFLP探针的两端测序，合成22-mer引物进行PCR扩增，扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。 2）序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）和位点特异相关引物（Allele－Specific Associated Primers，ASAP），对RAPD、AFLP片段两端测序，根据DNA序列，合成24-mer双引物进行PCR扩增。SCAR、CAP可以降低了成本，操作简便，稳定性强，对仪器要求低，可实现自动化分析mplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
分子标记技术及应用
分子标记技术和应用一、基于DNA杂交技术的分子标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,DNA限制片段长度多态性) RFLP是以Southern杂交为核心,应用最早的分子标记技术。
RFLP首先是在人类基因组研究中发展起来的,主要用于遗传疾病诊断和法医鉴定，RFLP的概念由人类遗传学家Botstein等首次提出，其原理为:碱基的改变与染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA片段酶切位点的变化,用限制性内切酶切割改变的DNA,将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后就会呈现出不同的带状分布,而具有差异的DNA片段就可通过Southern杂交检测出来。
利用RFLP技术可进行遗传图谱构建、基因定位、数量性状基因座定位(QTL)及遗传多态性分析等。
RFLP标记具有下列优点：结果可靠，这是由于限制性内切核酸酶识别序列的专一性决定的。
结果稳定，RFLP标记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响。
RFLP标记的等位基因间是共显性的，对选择隐形基因极为有利。
RFLP标记的非等位基因之间不存在基因互作，标记互不干扰。
RFLP起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，而且可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。
但RFLP标记也有自身的不足：需要大量高纯度的DNA （5-10μg）。
所需仪器设备较多、检测步骤多、技术较复杂，周期长、成本高。
通常都用到同位素，对人体有一定的伤害。
具有种属特异性，且只适合单拷贝和低拷贝基因。
多态性产生的基础是限制性酶切位点的丢失或获得，所以RFLP多态位点数仅1或2个，多态信息含量低。
二、基于PCR技术的分子标记技术1.基于随机引物PCR的分子标记技术在聚合酶链式反应（PCR）技术发明后（1987年，Mullis和Faloona），由于PCR技术操作简单，成功率较高，出现了一大批以PCR技术为基础的分子标记。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因克隆：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
DNA分子标记的种类
1.2.4 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction SPAR )
SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物， 但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR 的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。 扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP— PCR(microsatellite—primed PCR)。分析其多态性。 另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术， 即ISTR (Inverse Sequence—tagged Repeat）技术， ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的， PCR扩增的是反向重复序列之间的DNA序列。
1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD)
该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非 定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量 的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存 在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个 体拥有同一条(同源）的片段
STMS的发展和相近的分子标记种类
(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中 的探针； (2)把与SSR互朴的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作 引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA 的特定片段，即MP— PCR和RAMPs： (3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交．即 RAMPO或称为RAHM 或RAMS； (4)用5 ‘或3 ‘端加锚的SSR 作引物(如GG[CA] )，即 ISSR。
DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA)
第四章DNA长度多态性1-RFLP
两断端分别有突出的 碱基个数称为黏性末 端
两断端无突出的 碱基个数称为平端
三、电泳分离
• 原理： DNA是两性电解质，在同一电场强度下DNA片段 长度与片段的迁移率成反比。 • 在低压恒定电压下，将DNA样品放在0.6～0.8%琼脂糖凝 胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨3.0－ 23.0kp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。 • 分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA 则需要浓度较高的胶。 • 另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样 品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量 DNA （DNA marker）进行电泳。
限制性片段长度多态性 RFLP
限制性片段长度多态性RFLP
1 RFLP技术的简介
2
RFLP的实验步骤
3
RFLP技术在法医物证学的应用
RPLF技术的简介
• 个体差异大多数都是由于不编码蛋白的区域和没有重要调 节功能的区域发生中性突变。这些突变构成的差异成为 DNA多态性。 • 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。 这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与 正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现 不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。Leabharlann 量化DNA纹印的等位基因频率
原理：将连续随机变量的等位基因频率通过 数据处理成为离散行变量 方法：固定箱分析法和滑动箱分析法 固定箱分析法是将片段长度范围从大到小人 为分为若干个“箱”，位于一个箱的片段 是一个等位基因。
ACE基因多态性分析
刘嘉杰1353354ACE基因多态性分析【实验目的】1.从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA2.PCR法分析基因多态性分析【实验原理】以DNA为模板，ACE基因特异的引物序列位于287bp插入/缺失片段的两侧进行PCR扩增，故II型扩增片段长度约为490bp，DD型扩增片段长度约为190bp，ID型扩增片段为２个，分别为190bp和490bp。
根据PCR扩增片段的大小可进行多态性分析。
【实验步骤】1.基因组DNA抽提1.1溶液Ⅰ(10 ml )漱口20秒，收集漱口水；3000g×5min×RT，弃上清；1.2溶液Ⅱ(250 μl)重悬沉淀；3000g×1min，弃上清；1.3溶液Ⅲ(250 μl）重悬沉淀，振荡10秒；（变性）转至1.5 ml离心管，99℃×5min；1.4加溶液IV (50 μl)振荡5秒；（中和）3000g×5min，1.5上清转移至新0.5 ml离心管，取5 ul用于PCR.2.PCR反应1.1取消毒的0.2ml 离心管，加入下列成分：2×PCR Buffer mix(10 μl)DNA模板(5μl)引物混合物(10μM each) (2μl)ddH2O (3μl)1.2PCR扩增3.琼脂糖凝胶电泳检测1.1制备1.5％琼脂糖凝胶1.2点样，电泳1.3紫外灯下观察结果【注意事项】1.清洁口腔，充分漱口。
2.裂解细胞后震荡时间不易长，以免DNA断裂。
【实验结果】由电泳结果可以看到，明显分两个条带，并且接近190bp和490bp，故推测ACE基因型位ID。
荧光标记复合扩增讲解
也可降低成本和检材的消耗，减少
STR荧光标记检测技术是指将荧光染料标记到其中一个引物(一般选正链)的5'端,使随
PCR扩增产物都带有一个荧光染料分子。这种带有荧光分子的DNA片段在电
,迁移速度按片段分子量由小到大排列,当片段通过到阳极端的激
,荧光染料分子的共辄双键受到激发,发出一定波长的荧光,被扫描仪CCD接收,
5）高灵敏度和识别率。最低灵敏度为0.5ng。在中国汉族人群中的累积随机匹配概率为
×10-18，累积非父排除率为 0.9999996。
、中德美联：AGCU（国产） AGCU 10+1 STR荧光检测试剂盒
PCR复合扩增方法对人基因组DNA中STR位点的多
AGCU 10+1 STR荧光检测试剂盒可以进行11个DNA位点（10个STR位点和1
Amelogenin性别基因。Identifiler试剂盒中进行复合扩增的四核苷酸位点包括
所必需的13个核心STR位点，即CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、
、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、和vWA。获得的数据可以
ENFSI（欧洲法医学网）与Interpol（国际刑警组织）的要求。另外两个四核苷酸位点
、ProMega公司（美国）：PowerPlex 16 System荧光检测试剂盒
PowerPlex 16 System
包含CODIS系统13个基因座和PentaD、PentaE两个重复单元为5个bp的特别
Amelogenin基因座，可以进行性别检验。
1）16个位点同时在一个管子中扩增，在单一凝胶泳道中进行分析
扩增片段长度多态性
随机圹增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）
RAPD 技术的步骤
RAPD 扩增
DNA 的 制备
特点
检测未知序列的基因组DNA RAPD标记为显性标记，极少数为共 显性标记 引物无种族特异性 RAPD技术简单 RAPD标记的最大缺点是再现性差
RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异， 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。 RFLP技术主要包括以下基本步骤： DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移 到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分 析。 RFLP遍布整个基因组，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂， 不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的 标记。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma）限制性内切酶片段长 度多态性)作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它 运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用 RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从 酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在 污染环境下抗性分化进化水平上的差异。 与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD 而言， RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对 基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由 父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还 是由缺失、插入造成的。
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扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。
文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。
文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。
关键词：AFLP，分子标记技术，应用
目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。
分子标记一般指DNA标记。
分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术
（Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。
以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。
（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。
其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。
该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。
1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点
1.1. AFLP分子标记技术原理
AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。
由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。
使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。
扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。
Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。
双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp，在AFLP反应
中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。
目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个
识别位点的EcoR I。
AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。
接头(Artificial adapter)一般长14～18个碱基对，由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(Enzyme-specific sequence)组成。
常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物
的结合位点。
AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。
1.2. AFLP分子标记技术流程
AFLP分子标记技术包括3个步骤：(Ⅰ)DNA的准备。
即DNA的酶切以及与人工合成的寡
聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。
为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口。
(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。
AFLP 引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性
碱基三部分。
一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增。
所用引物可用放射性或荧光标记。
(Ⅲ)AFLP标记的统计。
AFLP
产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有一个
碱基差异的不同DNA片段。
[6](图1)
图1. AFLP分子标记技术流程图
1.3. AFLP分子标记的特点
（1）DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP标记。
一个0.5mg的DNA 样品可做4 000个反应。
由于AFLP分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。
（2）多态性高。
AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。
每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的标记数为50～100个，能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。
Becker等(1995)对多态性很差的大麦进行AFLP 分析，仅用16个引物就定位了118个位点[7]。
（3）)可靠性好，重复性高。
AFLP分析采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性降低，可靠性增高。
AFLP标记在后代中的遗传和分离中遵守孟德尔定律；种群中的AFLP标记位点遵循Hardy—Weinberg平衡。
（4）对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。
AFLP反应对模板浓度要求不高，在浓度相差1000倍的范围内仍可得到基本一致的结果。
但该反应对模板DNA的质量要求较为严格，DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。
2. AFLP分子标记技术的应用
AFLP作为一种较新的分子标记，近10年来，AFLP技术获得了很大进步，并展示出良好的发展前景，已经广泛应用于生命科学研究的诸多领域，如动物学、植物学、医学等方面。
AFLP技术自发明以来，作为一种重复性好、分辨力高的DNA标记，已经成为生命科学各领域，尤其是分子遗传学研究的一种重要工具和手段。
近年来，随着技术的不断改进和完善，该方法更加方便和易于操作，应用范围也在不断扩展。
该技术也存在着一些不足之处，如对样本DNA的质量要求很高从而易于导致偏差，设备费用较高等，但AFLP技术与microsatellites技术、序列信息的综合分析可作为遗传变异分析的主要工具。
因此，研究者应综合考虑AFLP技术的优点和局限，根据特定的研究内容和需要加以选择。