LI-COR Odyssey 红外荧光扫描成像
LI-COR辐射传感器
LI-COR辐射传感器LI-COR的辐射传感器分为三类--光量子传感器、日辐射强度传感器和光照传感器，其中光量子传感器能够测量波长在400～700nm的光合有效辐射并且可以应用在陆地和水下的各种环境中；日辐射强度传感器适合于测量全部的日光辐射（包括太阳加上天空）；光照传感器适合于测量以lux为单位的照明光，而这种光照是人眼可以看到的。
传感器校正注意点LI-COR公司所有的传感器（除了日辐射强度传感器外）都经过标准石英卤素灯校正，而标准适应卤素灯则是经过美国国家标准与技术学会（NIST）标定。
标准灯的精度是0.035%。
校正设备中的显微镜和激光使误差小于0.1%。
通过黑色的天鹅绒背景将散射光的误差也小于0.1%。
而绝对校正的精度则受到来源于美国国家标准与技术学会标准灯的不确定性所限制。
LI-COR公司光量子传感器绝对校正的技术指标是来源于术美国国家标准与技术学会标准灯强度的±5%（通常为±3%）。
LI-190SA光量子传感器LI-190SA光量子传感器主要被植物学家、气象学家、园艺学家、生态调查组和其它环境学家所利用，目的是为了测量空气中、植物生长箱和温室中的光合作用量子通量密度。
因为LI-190SA是计算机跟踪的光谱反应，所以可以准确测量自然和人工环境中的光合作用量子通量密度。
LI-191SA线性光量子传感器LI-191SA线性光量子传感器主要应用在空间不一致的环境中（如植物的树冠内部）测量光合有效辐射（PAR）。
重要特性1.传感器长度为1米，其感应波长为400～700nm，且该范围的波长正是测量光合有效辐射所推荐的；2.测量结果的输出单位为μmol m-2 s-1；3.测量结果是1米范围内的空间光合有效辐射的平均值，可以将实验误差最小化；4.一个人能够在短时间内完成多次测量；5.完全不受天气的影响（除了BNC接头），而且可以在无人管理的情况下放置在野外。
应用范围LI-191SA可以用来长期监测作物树冠内部光量子通量的变化。
LI-COR Odyssey 红外荧光扫描成像
一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
五种国内常用流感疫苗的分析比较
五种国内常用流感疫苗的分析比较摘要】本课题主要对2009-2010年度的针对流感病毒的四个病毒颗粒裂解疫苗（福禄立适?、华兰生物生产的流感病毒裂解疫苗、安尔来福、凡尔灵）和一个只含病毒表面糖蛋白的亚单位疫苗（爱阁力保?）进行了与免疫保护相关的有效分子的测定，同时对疫苗制备过程中可能对机体产生具有副作用的分子也加以分析。
结果显示各疫苗均能检测到神经氨酸酶活性和血凝素蛋白的红细胞凝集活性，其中安尔来福的神经氨酸酶活性高出其他产品10倍，福禄立适?则显示出最佳的红细胞凝集活性;基质蛋白仅在华兰生物生产的流感病毒裂解疫苗及安尔来福这两个裂解病毒颗粒疫苗中明显被检测到。
另外，各疫苗中鸡卵清蛋白含量都很低，但安尔来福的含量明显高于其他疫苗，本研究结果可对疫苗选择提供参考。
流感是由流感病毒(influenza virus)引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，在世界各国广泛流行，每年在世界范围内造成25至50万人死亡[1]，是危害人类健康的重要传染病之一。
近些年来，我国的生态环境严重破坏，人流感的发生和发展规律发生了较大变化。
发病频率的上升，造成了严重的社会影响和重大的经济损失。
给予高危险人群适当时间接种流感疫苗仍然是预防流感的最佳方法。
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种含有8个不同基因片段的分节段RNA病毒。
由于该病毒的复制所需的是以RNA为模板的RNA多聚酶，不具纠错功能（与DNA多聚酶不同），因此流感病毒极易发生抗原突变也叫抗原漂移（antigen drift），使得机体难以累积免疫保护力[2]。
此外在A型流感病毒中，除水禽是它的天然宿主，它偶然可交叉感染人或其他哺乳动物。
在这种不同种动物交叉感染过程中，病毒遗传物质易发生较大变异，导致抗原转变（antigen shift），形成新血清亚型株。
由于抗原转移和抗原漂移，都使得准确预测当年流感病毒株几乎不可能，给每年流感的防控带来巨大困难[3]。
做Western blot仪器Odyssey
In-Cell Western Assay
In-Cell Western 工作流程
细胞培养 Culture cells to confluency in 96-well or 384-well plates 处理细胞 Treat cells (inhibitor, stimulator, etc…)
Odyssey VS ECL流程
ECL Odyssey
跑胶
转膜 封闭 结合一抗、洗涤 结合红外染料标记二 抗、洗涤，成像
1
2 3 4 5 6
跑胶
转膜 封闭 结合一抗、洗涤 结合酶标记二抗、 洗涤 发光试剂盒 暗房曝光成像
7
荧光直接检测
●信号持久 ●不需要底物 ●不需要底片/暗室
INFRARED APD DETECTOR ON-SCREEN Display
Incubate with IRDye® secondary antibodies (e.g.: IRDye® 680 and IRDye® 800CW)
Incubate with IRDye® secondary antibody and a DNA stain (e.g.: To-Pro-3)
Odyssey系统扫描 Scan plate directly and analyze on the LI-COR Infrared Imaging Systems.
固定细胞 Fix cells (3.7%formaldehyde, methanol or Prefer)
透化细胞 Permeabilize cells (0.1%Triton-X 100)
Incubate with 2 primary antibodies
Incubate with 1 primary antibody
Odyssey红外荧光扫描成像系统的特点及应用
Ｏ ｙｓ 红 外荧 光 扫 描 成 像 系 统 （ｎ ａ ｄＩａｉ ｙｔ ｄｓ ｙ ｅ Ｉｆｒ ｇ ｇＳｓ ｍ） ｒｅ ｍ ｎ ｅ
技 术 系 统 ：相 对 于 传 统 化 学 显 色 法 （ Ｄ Ｂ 显色 ） 化学 发 光 如 Ａ 、 法 （ Ｅ Ｌ 等 ， ｄｓ ｙ 较 大 改 进 。 如 Ｃ ） Ｏ ｙｓ 有 ｅ
溶液 、 阴性对照样 品溶 液各 ｌ ， ０ 分别 注入液相色谱仪 ， 行 进 测定 。结果供试品 色谱 中， 与对照 品色谱 相应 的位置 上 ， 在 有相 同保 留时间的色谱峰 ， 而阴性对 照样品溶 液在 此保 留时
间无 干 扰 。因 此 可 在 此 系 统 条 件 下 对 黄 连 进 行 定 量 分 析 。 ２ ６ 线 性 关 系考 察 ． 精 密 吸取 ０ ２４ ｇｍ 的盐 酸 小 檗 碱 ．０８ｍ ／ ｌ 对 照 品溶 液 １２３４ ５ｍ ， 别 置 ｌ Ｊ 瓶 中 ， 甲 醇 稀 释 、、、 、 ｌ分 ０ｒ 量 ｎ 加 至刻 度 ， 匀 ， 得 。制 得 ０００４ ｇｍ 、 ．４ ６ｍ ／ ｌ０ 摇 即 ．２ ８ｍ ／Ｊ０ ＯＯ９ ｇｍ 、 ．
各 ｌ ， ０ 按上述色谱条件实验 ， 测定峰面积 ， 以外标法计算供
试 品溶 液 中 盐 酸 小 檗 碱 的 含 量 。通 过计 算 ， 号 ０００ 批 ７５３的一
清颗粒的盐酸小檗碱含量为 ２ ８６ｒ ／； 号 ００ １ ．１ ｇ 批 ａ ｇ ７ ８５的颗 粒
的 含 量 为 ２６ ｇｇ￣ 号 ００２ 的 颗 粒 含 量 为 ２ ８ ｇｇ ．７ｍ ／ ； ７ ９１ ．０ｍ ／。
ｌ ， ０ 进样分析 ２ ， 次 记录色谱 图， 计算盐 酸小檗碱 回收率 为
１０ ０ ％ ，Ｓ ０ ．９ Ｒ Ｄ为 ０ ３ ％ 。结 果 见 表 １ ． ９ 。
Odyssey红外荧光扫描成像系统的特点及应用
Odyssey红外荧光扫描成像系统的特点及应用【关键词】红外荧光扫描成像系统 Western印迹法Odyssey红外荧光扫描成像系统(Infrared Imaging System)是一套具有高灵敏度的实验系统，在医院、科研院所中得到越来越多的应用，日益受到人们的关注和青睐。
现将Odyssey工作原理与技术特点、应用范围、操作流程、常见问题及解决策略等介绍如下。
1 Odyssey工作原理与技术特点Odyssey是通过在二抗上标记荧光染料，再通过固定波长激光激发后，采集染料发出荧光信号来确定目的蛋白含量的技术系统。
相对于传统化学显色法(如DAB显色)、化学发光法(如ECL)等，Odyssey有较大改进。
Odyssey系统可直接在膜、凝胶和微孔塑料板中对样品进行检测，该系统采用2个红外激光作为激发光，波长分别为680 nm和780 nm，检测则配置2个720 nm和820 nm波长高灵敏度二极管。
Odyssey优于传统方法的主要特点是高灵敏度。
一般荧光染料激发和检测波长都在可见光谱区，在此范围内膜、凝胶和微孔塑料板也会发出荧光，容易产生高背景荧光干扰，影响实验结果，而Odyssey采用红外波长区，此时大分子物质几乎不发出任何荧光，在检测中背景荧光很低，从而有较好信噪比。
Odyssey另一特点是直接检测，可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料最大吸收值与Odyssey两个激发波长相匹配，其发射波长又与Odyssey两个检测波长相匹配，同时发射波长峰值相隔100 nm，这使Odyssey有较大灵敏度和较小信号交叉。
Odyssey系统检测不需要曝光和底物显色，也不需要X光片，操作简便，另外配有功能全面的软件支持，结果分析如生物大分子分子量确定、定量及图像处理也很容易。
Odyssey系统操作简单，双色检测，可一次同时检测两种目的分子，这样更直观、更省时。
由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有更长使用寿命，且维护要求也低。
Odyssey红外激光成像系统 —蛋白研究的多功能平台[知识荟萃]
![Odyssey红外激光成像系统 —蛋白研究的多功能平台[知识荟萃]](https://img.taocdn.com/s3/m/3706d986360cba1aa811dace.png)
红外荧光 VS 化学发光
成像效果
Odyssey 曝光３０秒 曝光１分钟 曝光５分钟 曝光１０分钟
红外+荧光 DEMO
实验目的 检测培养细胞转染外源基因的表达状况
实验步骤
Odyssey: 膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像 ECL: 膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像
DETECTOR
INFRARED LASER DIODE
Antigen on membrane
Primary antibody binds to antigen
IRDye labeled secondary antibody binds to primary
antibody
荧光－准确定量
CHEMILUMINESCENCE • 动态信号－信号随时间变化 • 信号不与目标蛋白浓度成比例关系
Saturation
ODYSSEY • 静态信号－信号不随时间变化 • 信号和目标蛋白浓度成比例关系
INTENSITY
Background 0,0
TIME
High concentration / signal
0,0
Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
* Two-color detection requires primary antibodies from different hosts
双色－ERK蛋白的磷酸化
Anti-EGFR and anti-phospho-EGFR antibody specificity in A431 cells
licor odyssey 红外荧光扫描成像
一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
紫外诱导红外荧光成像
紫外诱导红外荧光成像珍妮弗·马斯（Jennifer Mass）1.分类紫外诱导红外荧光成像（ultraviolet-induced infrared fluorescence imaging）属于非破坏式成像技术。
检测对象不会因紫外线暴露而受损。
2.说明这种技术需采用发射波长365 nm的长波紫光源作为激发源。
这种高能辐射会导致绘画材料发出可见光段、红外段的荧光或低能辐射。
当一种化合物吸收波长较短的电磁辐射，电子提升到更高的电子能级时，就会发出荧光。
这些电子在返回基态前会经历一个非辐射弛豫过程，因此发射出的光比吸收光波的波长更长（能量更低）。
在这种情况下，无论入射辐射的波长是多少，一种固定电子结构的分子只会产生一种固定波长的荧光。
这种现象会发生在一些无机质的绘画颜料上，包括锌白和镉基颜料（如镉黄、镉橙和镉红）、绘画中假性颜料（如茜红、紫罗兰和印度黄）所包含的有机染料上也可以观察到这种现象。
紫外激发可见荧光时，可同时观察到颜料中的所有荧光材料（包括天然树脂光油和蛋白质黏结剂）发出的荧光。
因此对这种成像的解读是非常具有挑战性的。
相比之下，受紫外诱导发红外光的材料比发可见光的材料少得多，因此，紫外诱导红外荧光成像是一种高选择性的技术。
可观察到紫外诱导红外发光现象的颜料粉包括镉黄、镉橙、镉红、埃及蓝、中国蓝和中国紫。
可以用带可见光滤镜（屏蔽715 nm以下光波）的商用相机拍摄记录这种发光现象。
3.应用这种技术可屏蔽一般颜料填充料／基料（如锌白）和有机颜料（如茜素红和印度黄）发出的可见荧光。
可用它来检测镉系颜料发出的荧光。
例如，镉黄的最大荧光发射波长高达750 nm，镉橙的最大荧光发射波长高达800 nm，镉红的最大荧光发射波长高达850 nm，埃及蓝的特征最大荧光发射波长高达910 nm。
因此850~910 nm的滤镜可用于识别埃及蓝颜料的荧光，同时还可屏蔽镉系颜料的荧光。
4.局限性紫外诱导红外荧光成像是一种非常强大的成像技术，但仅适用于少数品种的颜料粉。
高通量快速细胞蛋白检测方法——In-CellOn-CellWestern
⾼通量快速细胞蛋⽩检测⽅法——In-CellOn-CellWestern样品数量太多，如何做⾼通量WB？WB实验周期太长，想进⾏快速检测？蛋⽩分⼦量>400KD的WB怎么做？磷酸化蛋⽩、细胞膜内蛋⽩检测困难？恭喜你，打开本⽂，你将获得⼀次性解决以上问题的新型WB⽅法——In-Cell/On-Cell WesternIn-Cell/On-Cell WesternIn-Cell/On-Cell WesternIn-Cell/On-Cell Western是在96孔板或384孔板培养的细胞上依据抗原抗体结合原理,利⽤⽬标蛋⽩的特异性抗体及近红外荧光染料标记的⼆抗，对⽬标蛋⽩进⾏定量分析的技术。
1In-Cell/On-Cell Western的实验流程实验流程步骤1以⼀定密度在96/384孔板上培养细胞2⽣长到合适密度后，加药物或其他处理3加⼊多聚甲醛进⾏固定4加⼊Triton X-100对细胞进⾏透化处理5BSA封闭30 min6加⼊⼀抗孵育1h7加⼊荧光标记⼆抗，洗涤检测2In-Cell/On-Cell Western提⾼⾼通量实验的可重复性和准确性HeLa细胞分别⽤10uM的CAM和DMSO处理7天，In-Cell Western检测氧化磷酸化复合物的的⽔平，统计学数据表明，对照组、DMSO和CAM处理组的变异系数CV均较低，重复性好。
GAPDH和PMLC20通过WB分别在两张膜上各做13个重复，变异系数为0.27；GAPDH和PMLC20通过ICW检测，30个重复，变异系数为0.08-0.16。
与化学发光膜WB法相⽐，ICW的通量更⾼，变异系数更低，提⾼实验结果重复性和准确性。
与膜上WB法相⽐， In-Cell/On-Cell Western更快速便捷3In-Cell/On-Cell Western的应⽤举例01Insulin Rearch02Signaling Pathways03Drug Rearch04RNAi05Apoptosis06Ion Channel01.Insulin RearchDose-dependent results of human insulin receptor activation. A. Images of ICW signals detected by an Odyssey® Infrared Imaging System (LI-COR, Bad Homburg, Germany) with the 700- and 800-nm channels. The signals obtained from DNA and cell stain with DRAQ5™ and Sapphire700™ excited at ~680 nm and detected at ~700 nm are displayed in red, whereas the signals obtained from detecting the phosphorylated human insulin receptor (p-hIR) excited at ~780 nm and detected at ~800 nm are displayed in green. The composite overlay shows both measurements in one image.measurements in one image.值得注意的是，胰岛素筛选主要是基于胰岛素刺激细胞后，对细胞膜受体磷酸化⽔平进⾏检测，因其对细胞培养需求⼤，普通WB难以实现，⽽LI-COR Odyssey 的In-Cell Western能对⼈胰岛素和胰岛素类似物的效价进⾏⾼灵敏度的定量检测，因此美国药典（United States Pharmacopoeia，USP）推荐⽤LI-COR Odyssey的In-Cell Western⽅法进⾏胰岛素筛选。
继发性甲状旁腺功能亢进症来源的甲状旁腺原代细胞的培养及鉴定
甲状旁腺主细胞在机体甲状旁腺素(PTH)的分泌和体内钙磷代谢等方面发挥着重要作用，进而参与包括继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT ）在内的多种疾病的病理过程［1］。
SHPT 的主要特征为PTH 升高，而PTH 的合成和分泌受到甲状旁腺细胞膜上钙敏感受体（CaSR ）的调节［2］。
既往研究表明，在甲状旁腺的发育过程中神经胶质细胞缺失因子2（GCM2）特异性表达，是关键的调控因子［3,4］。
目前，对SHPT 的相关研究多局限于动物实验和离体的病理学检查等［2,5-7］，关于人来源的原代甲状旁腺细胞模型仅存在于原发性甲状旁腺功能亢进（PHPT ）中［8-11］，尚缺乏SHPT 人来源的原代甲状旁腺细胞模型，存在实验受限于多种复杂因素影响、细胞内相关机制难以阐明、实验动物与人类存在先天差异性及病理学检查存在实验局限性等诸多缺点［12-14］。
因此，建立SHPT 原代细胞模型对进一步的研究至关重要。
本研究通过对培养的SHPT 细胞进行PTH 、CaSR 和GCM2的检测，成功分离并建立了原代甲状旁腺细胞模型，为进一步研究SHPT 的发病机制、药物疗效、调控机制等提供了前期基础。
1材料和方法1.1材料人甲状旁腺原代细胞（中南大学湘雅三医院）。
DMEM/F12培养液（赛默飞世尔公司）。
细胞胶原酶ICultivation and characterization of primary human parathyroid cells from patients with severe secondary hyperparathyroidismLI Peiting,LI Gang,LIU Lidan,HUANG Shan,LI Jun,WU WeiDepartment of Breast Thyroid Surgery,Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410013,China摘要：目的分离、培养及鉴定继发性甲状旁腺功能亢进症患者来源甲状旁腺。
交泰丸组分配伍改善小鼠胰岛素瘤B细胞脂质沉积的机制研究
交泰丸组分配伍改善小鼠胰岛素瘤B细胞脂质沉积的机制研究作者：唐悦恒赵莉邹欣徐丽君陆付耳董慧来源：《世界中医药》2021年第19期摘要目的：研究交泰丸中主要活性成分小檗碱（BBR）、肉桂酸（CA）及其配伍（BBR/CA）對软脂酸（PA）诱导的NIT-1胰岛B细胞内脂质沉积的影响。
方法：将细胞在PA的培养基中培养24 h，建立高脂诱导的细胞内脂肪沉积模型。
分为模型组、BBR组、CA 组、BBR/CA组、二甲双胍（Met）组，分别给予相应药物干预，另设对照组。
油红O染色法评估细胞内脂肪沉积情况;酶法检测细胞内三酰甘油（TG）含量;使用Western Blotting和实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及其下游脂肪生成和脂肪酸氧化基因的表达水平，包括脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（p-ACC）、肉碱酰转移酶-1（CPT-1）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）。
结果：PA诱导使NIT-1胰岛B细胞中脂肪沉积明显增加，TG含量显著升高，AMPK蛋白及其下游靶标（如p-ACC、CPT-1等）表达显著降低。
同时，AMPK下游脂肪生成基因包括SREBP-1c mRNA、FAS和ACC蛋白表达显著增加。
BBR单药和BBR/CA配伍处理优于CA 单药，可显著逆转NIT-1胰岛B细胞中上述基因表达水平的变化。
结论：在体外，交泰丸活性组分配伍可减少高脂诱导的NIT-1胰岛B细胞内脂肪沉积，其机制可能与减少脂肪合成和增加脂肪氧化有关。
关键词交泰丸;小檗碱;肉桂酸;NIT-1胰岛B细胞;脂肪Abstract Objective：To investigate the effects of berberine（BBR） and cinnamic acid （CA），the main active compounds of Jiaotai pills，and the combination of berberine and cinnamic acid（BBR/CA） on palmitic acid（PA）-induced lipid accumulation in NIT-1 pancreatic B cells.Methods：Cells were incubated in culture medium containing PA for 24 hours to establish a model of lipid accumulation induced by high fat.Then treatments with BBR，CA，the combination of BBR and CA（BBR/CA） and Metformin（Met） were performed respectively，and a control group was set up.Intracellular lipid accumulation was assessed by Oil Red O staining and TG content was measured by enzymatic assay.The expression of adenosine monophosphate-activated protein kinase（AMPK） protein and its downstream lipogenic and fatty acid oxidation genes，including fatty acid synthase（FAS），acetyl-CoA carboxylase（ACC），phosphorylation acetyl-CoA carboxylase（p-ACC），carnitine acyl transferase 1（CPT-1） and sterol regulatory element binding protein 1c（SREBP-1c） were determined by Western blot or real time polymerase chainreaction（RT-PCR）.Results：PA induced an obvious lipid accumulation and a significant increase in intracellular TG content in NIT-1 pancreatic B cells.PA also induced a remarkable decrease in AMPK protein expression and its downstream targets such as p-ACC and CPT-1.Meanwhile，AMPK downstream lipogenic genes，including SREBP-1c mRNA，FAS and ACC protein expressions，were increased significantly.Treatments with BBR and BBR/CA，superior to CA，significantly reversed the above genes changes in NIT-1 pancreatic B cells.Conclusion：It can be concluded that in vitro，the active compounds of Jiaotai pills inhibits PA-induced lipid accumulation by decreasing lipogenesis and increasing lipid oxidation in NIT-1 pancreatic B cells.Keywords Jiaotai pills; Berberine; Cinnamic Acid; NIT-1 pancreatic B cells; Lipid中图分类号：R587.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.002糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种由胰岛素分泌缺陷和（或）胰岛素功能缺陷引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病[1]。
近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用
近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用杨昕霆;阎海霞;沈珝琲;张业【摘要】目的应用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统筛选去甲基化酶KDM3A 去磷酸化的磷酸酯酶.方法使用磷酸酯酶干扰质粒转染HEK293T细胞,使用磷酸化的KDM3A抗体对细胞进行杂交,近红外荧光染料DRAQ5标记细胞核,利用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统对细胞进行荧光扫描,荧光强度的比值可代表细胞内相对KDM3A磷酸化水平,进而筛选出相关的磷酸酯酶.结果磷酸酯酶广谱抑制剂冈崎酸OA处理转染后的细胞,近红外双荧光扫描系统可以检测到KDM3A的磷酸化,初步筛选出4个可能参与KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶亚基.结论近红外双荧光系统可以应用于磷酸酯酶的初步筛选.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2014(043)005【总页数】3页(P52-54)【关键词】奥德赛近红外双荧光扫描系统;KDM3A;磷酸酯酶【作者】杨昕霆;阎海霞;沈珝琲;张业【作者单位】100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R393奥德赛(Odyssey)近红外双荧光扫描系统是近年来引进的一种新技术。
近红外双荧光扫描系统的工作原理是使用激光激发带有特殊标记的抗体或者荧光染料，受激发的抗体或染料释放出近红外荧光，样品发射出的700nm和800nm近红外荧光信号可以被扫描仪器接收，并且计量近红外荧光值，从而完成蛋白质的定性或定量测量。
PearlTrilogy小动物活体成像系统-生物通
Pearl® Trilogy 近红外荧光&生物发光小动物活体成像系统2LI-COR公司美国LI-COR公司是近红外荧光技术研究的创始者。
公司自1971年成立以来，一直致力于近红外荧光技术标记和检测系统的研究。
公司基于近红外荧光专利技术研发的Odyssey双色红外激光成像系统已经成为定量Western Blot检测的金标准。
Pearl Trilogy是LI-COR公司推出的一款专业的近红外荧光和生物发光成像系统，专为小动物活体成像量身定做。
该系统保持了近红外荧光在活体成像中背景低，穿透力好的特点，同时具备生物发光检测的能力，满足客户多样的需求。
此外，仪器操作简便，您无需成为仪器的操作专家，就可以获得高质量的实验结果。
2FieldBrite TMXi 2 技术是Pearl Trilogy成像系统的核心。
FieldBrite TM Xi 2 专门优化用于小动物活体成像，保证获取高质量的实验数据。
确保整个荧光成像区域有均匀的光照，从而能够准确地检测到非常小的变化。
以近红外激光器为光源，获得最佳的信噪比，从而检测到动物体内深层的目标。
业界领先的6个数量级的动态范围，避免信号饱和，因而能够用相同的相机参数获取图像。
将小鼠器官（大脑）放置在6个不同的位点分别成像，整个视野的CV值<3%。
重复性对于研究至关重要。
因为很多研究是纵向研究，所以图像上观察到的变化必须反映真实的生物学变化，而不是源于光学系统的局限。
FieldBrite Xi 2能够产生均匀的光照（CV< 3%）。
激光光源在整个研究过程中保持稳定，从而保证图像上观察到的变化源于真实的生物学过程。
均匀照明卓越的灵敏度宽动态范围3组织对近红外波段的光吸收最低，且该波段的光散射也少，从而保证更好的组织穿透性。
在近红外波段，动物组织的自发荧光显著降低，因此能够得到更优的信噪比。
近红外激光器的激发光波长分布集中、能量高，与近红外荧光染料相得益彰，提升整体表现。
蛋白荧光染料大比拼
蛋白荧光染料大比拼要：随着蛋白质组学的发展，定量蛋白质组和多重分析越来越流行，考马斯蓝染色及银染已经无法满足更高的要求。
此时，荧光染料的优势就凸显出来。
生物通这就带大家看看市场上主流的蛋白荧光染料，包括总蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。
另外，本文还会介绍一些特殊用途的荧光染料。
几十年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及相关的blot已经成为蛋白分析的主流技术。
考马斯蓝染色和银染也就成了我们最熟悉的染色方法。
不过，随着蛋白质组学的发展，定量蛋白质组和多重分析越来越流行，这些染料已经无法满足更高的要求。
此时，荧光染料的优势就凸显出来。
生物通这就带大家看看市场上主流的蛋白荧光染料，包括总蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。
另外，本文还会介绍一些特殊用途的荧光染料。
总蛋白染料与传统的考马斯蓝染色相比，荧光染色可将检测的灵敏度降至1 ng以下，与银染相当；而与银染相比，荧光蛋白染料的线性范围比银染宽很多，一般可达3个数量级以上，且对不同种蛋白的染色强度变化小，与蛋白质量成清晰的线性关系，而不依赖于多肽序列及糖基化程度。
目前的荧光染色法与后续的质谱分析和Edman测序等技术兼容，因此无论在1D还是2D电泳领域都日渐受到研究人员的青睐。
蛋白荧光染料需要一个紫外光透射仪（下紫外）才能观察，当然，有激光扫描仪时效果更佳。
名气最大的总蛋白荧光染料当属Invitrogen旗下Molecular Probes公司持有专利的SYPRO® 荧光蛋白染料系列。
这一最早上市的荧光蛋白染料系列包括了SYPRO® Ruby，SYPRO® Red，SYPRO® Tangerine几种不同颜色。
其中紫红色的SYPRO® Ruby最为著名，也有人翻译成SYPRO红宝石。
它的检测极限为0.25-1 ng，线性范围超过3个数量级。
它与碱性氨基酸和多肽主链结合，因此不同蛋白之间的差异性小，可进行更为准确的定量。
辛伐他汀经由雾化吸入途径给药抑制过敏性小鼠气道高反应性和气道重塑
辛伐他汀经由雾化吸入途径给药抑制过敏性小鼠气道高反应性和气道重塑*徐蓝1，朱磊1，孙云2△（1苏州大学附属苏州九院，苏州市第九人民医院药剂科，江苏苏州 215200；2扬州大学医学院，江苏扬州 225001）［摘要］目的：探讨雾化吸入途径给予辛伐他汀（simvastatin， Sim）对哮喘模型小鼠气道高反应性和气道重塑的影响。
方法：选取BALB/c小鼠，采用卵白蛋白（ovalbumin， OVA）诱导建立哮喘小鼠模型。
随机分为对照（control）组、模型（vehicle-OVA）组、Sim（5、20 g/L， i.h）-OVA组、Rho激酶抑制剂Y-27632（10 mg/kg， i.n）-OVA组和地塞米松（dexamethasone， DXM； 1 mg/kg， i.p）-OVA组，每组10只。
OVA末次攻击24 h后以不同浓度乙酰甲胆碱（methacholine， MCh）诱导小鼠产生气道高反应性。
应用生物信号记录系统测定气道阻力（airway resistance， R L）和动态肺顺应性（dynamic lung compliance， C dyn ）以评价Sim的作用强度；对各组小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveo‐lar lavage fluid， BALF）炎症细胞分类并计数；肺组织行HE和Masson染色评估炎症细胞浸润程度和黏膜下胶原沉积；Western blot法测定各组小鼠肺组织中RhoA蛋白含量。
结果：与vehicle-OVA组比较，预先雾化吸入Sim 5 g/L-OVA组和Sim 20 g/L-OVA组均下调MCh诱导的哮喘模型小鼠R L值（P<0.05，P<0.01），升高C dyn值（P<0.05，P<0.01），降低过敏性小鼠气道高反应性；降低BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞数、巨噬细胞数和中性粒细胞数（P<0.01）；Sim 20 g/L-OVA组小鼠肺组织炎症浸润和气管周围胶原沉积面积减少，胶原容积分数减小（P<0.01），肺组织中RhoA蛋白水平降低（P<0.05）。
Odyssey 红外荧光扫描成像系统实验操作流程
Odyssey 红外荧光扫描成像系统实验操作流程：1. 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子克隆实验手册操作2. PVDF膜甲醇浸湿，再用去离子水冲洗后转移到转移缓冲液中平衡20min。
3. 裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡。
4. 转膜顺序：负极－专用滤纸－电泳胶－PVDF 膜－专用滤纸－正极。
5. 电转后，封闭液中封闭1～3hour。
注：封闭液可以用5%的进口脱脂奶粉（用PBS 溶解），因为Tween-20 和BSA 会对Odyssey 造成高背景，所以在封闭完成前尽量不要让膜接触到这两种物质。
6. 封闭液稀释一抗（建议比例为1：1000－1：5000），膜在一抗中室温至少1hour 或者4℃过夜。
注：抗体的稀释倍数与抗体质量和实验中的蛋白样本相关。
同时，不同的抗体可能需要在抗体稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20 来降低背景，可以根据要检测的蛋白以及平时操作经验来选择是否在一抗稀释液中添加0.1-0.2%的Tween-20。
7. 之后用TBST 于摇床洗膜4×5mins。
8. 封闭液稀释二抗，膜在二抗中室温于摇床1hour（避光）。
注：如果一抗稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的Tween-20。
如果使用Tween-20 的同时添加0.01-0.02%的SDS 于二抗稀释液中可以比较好的降低背景。
9. 洗膜同13（避光）10. 用PBS 洗去膜上残留的Tween-20，接下来可直接进行扫描。
Odyssey仪器的操作流程：1．在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。
2．用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。
将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。
4．双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。
点击scan 快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，开始扫描。
6．扫描结束后对扫描结果进行分析。
高蛋白饮食对肝硬化大鼠认知和大脑代谢的影响
高蛋白饮食对肝硬化大鼠认知和大脑代谢的影响【摘要】目的探讨高蛋白饮食对胆总管结扎（BDL）致肝硬化模型大鼠运动功能、焦虑、记忆过程的影响。
方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术（SHAME）标准饮食对照组（Scon 组）、假手术（SHAME）接受高蛋白饮食的对照组（Scon-P）组、胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）标准饮食（Bcirr）组、胆总管结扎（BDL）接受高蛋白饮食的胆总管结扎组（Bcirr-P）。
选用一些行为实验检测大鼠运动功能、焦虑水平，评估参考记忆和空间记忆的损害。
使用细胞色素氧化酶免疫组化评估中枢神经系统区域的代谢活动。
结果旋转实验和十字迷宫四组均保持运动功能和正常焦虑水平；胆总管结扎（BDL）组不管何种饮食，空间记忆和主动回避行为均受损（P ＜0.01）。
然而，接受高蛋白饮食的肝硬化鼠在空间记忆任务中显示较长的逃脱潜伏期（P ＜0.01）。
胆总管结扎组海马和下丘脑显示能量活化不足（P ＜0.01）。
结论胆管结扎（BDL）高蛋白摄入组加重了肝硬化空间记忆障碍和主动学习任务，改变了运动和焦虑水平，且胆管结扎高蛋白饮食组并未影响到细胞色素氧化酶的细胞活性减退。
【关键词】肝昏迷；饮食；主动回避；空间参考记忆；细胞色素氧化酶；中枢神经系统肝性脑病是肝病患者发生的的中枢神经系统的并发征，肝性脑病的患者表现为神经肌肉、神经精神病学、行为异常的症状。
肝性脑病的患者认知功能的异常主要是以记忆力减退、注意力不集中、执行功能障碍和空间定向障碍为特点[1]。
运动症状也在肝性脑病患者中出现[2]。
智力活动异常主要是由于受损的肝脏不能代谢神经毒物，导致其在大脑的累积，从而影响神经递质和组织形态学细胞的变化，其中主要影响大脑星形胶质细胞[3]。
目前已经有许多动物实验模型已经建立并研究肝性脑病，尽量复制慢性肝硬化的临床特性、认知和运动症状。
几例临床研究报道慢性口服四氯化碳可引起学习和空间记忆相关的损害[1]。
Odyssey红外激光成像系统—蛋白研究的多功能平台
10
4
信号强度
302 62
30
19
（Odyssey软件分析结果）
10:4:2:1 稀释
结论
Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大 Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 Odyssey扫描图能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 Marker
红外荧光优点－直接检测，操作简便
Results Overlaid
观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases)的磷 酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用 抗 兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red)
EMSA
• 起初是用32P同位素标记寡核苷酸探针,但是由于同位素的
放射性很强,而且半衰期为14天,从定购同位素到标记，做
完试验,必须14天完成,既不安全也不方便； • 地高辛标记探针的非放射 EMSA 实验技术，其缺陷是标记 的探针纯化后灵敏度弱； • 红外荧光素技术的出现，可以解决 EMSA 实验中的探针示 踪问题，还可以进行双色标记，检测竞争性结合。
应用三－双色EMSA
700 and 800 Overlay
700 nm Channel
DNA-Protein Complex
Unbound DNA IRDye 800
800 nm Channel
Unbound DNA IRDye 700
Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).
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一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
6.其它：通用插头接线板（至少3个插孔）`三．培训所需试剂设备及样品Western Blot实验所需试剂耗材：客户自备的蛋白样品(建议为新鲜制备的蛋白，最好用western验证过)细胞裂解液SDS-Page胶电泳缓冲液PVDF膜(硝酸纤维素膜也可)转移缓冲液PBSTBS封闭液（建议使用5%进口脱脂奶粉）Tween-20一抗荧光标记的二抗（IRDye700和IRDye800）锡箔纸（通用试剂详细配方请参照《分子克隆实验指南》）其它配套设备：1)蛋白电泳仪2)脱色摇床3)转膜仪4)分子生物学实验室常用工具：加样器，Tip头，量筒，离心管，离心机，冰盒等。
以上物品请您提前准备妥当，我们将使用以上物品进行仪器使用的培训工作。
四、培训程序及时间安排（请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，方便以后有人员变动您也能进行仪器内部培训。
）1.仪器安装及使用培训（2小时）2.实验安排布置，用户实际操作培训（不同的实验时间有所不同，以WesternBlot为例，时间为1天半）。
实验的安排上建议同时做红外荧光检测与化学发光检测的对比实验，方便两种方法结果的对比。
3.软件基本功能综述及使用培训（1小时）五、仪器及试剂系统介绍1.Odyssey红外成像系统技术特点讲解2.仪器系统组成和工作原理讲解3.配套试剂介绍六．实验操作流程实验设计：化学发光及荧光检测对比实验1先将蛋白样品做3个浓度梯度稀释如1：10，1：100，1：1000，加上未稀释的蛋白共4个实验样品，再加上预染marker我们称之为一组样品2蛋白电泳上样的顺序为预染marker，未稀释样品，1：10，1：100，1：1000，预染marker，未稀释样品，1：10，1：100，1：1000（两组样品中间建议空一个样品孔，方便以后的剪膜）3转膜完成后，开始进行封闭及一抗孵育的操作步骤4一抗孵育及洗膜完成之后，将两组样品膜剪开。
两张膜分别按照荧光检测及化学发光检测的方式进行二抗的孵育，洗脱及结果的分析。
Western的实验流程可以参照下面的荧光检测Western操作流程，部分化学发光的实验流程请参照所在实验室的方法。
荧光检测Western操作流程（以硝酸纤维素膜为例）：1.吸去培养液，用预冷的PBS洗细胞两次2.加入细胞裂解液，4℃放置20min3.用细胞铲刮下细胞，转移到1.5ml离心管，13000rpm，4℃，20min4.取上清5.取20-100µg蛋白进行电泳6.电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子克隆实验手册操作7.硝酸纤维素膜于转移缓冲液（PBS）中平衡20min。
（如果使用PVDF膜，请先用甲醇浸湿，再用去离子水冲洗后转移到转移缓冲液中平衡20min。
）8.电泳胶置转移缓冲液中平衡20min。
9.裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡。
10.转膜顺序：负极－专用滤纸－电泳胶－PVDF膜－专用滤纸－正极。
15V，电转30min。
11.电转后，封闭液中封闭1～3hour。
注：封闭液可以用5%的进口脱脂奶粉（用PBS溶解），因为Tween-20和BSA会对Odyssey造成高背景，所以在封闭完成前尽量不要让膜接触到这两种物质，所以麻烦您确定封闭液中没有Tween-20和BSA成分。
12.封闭液稀释一抗（建议比例为1：1000－1：5000），膜在一抗中室温至少1hour或者4℃过夜。
注：抗体的稀释倍数与抗体质量和实验中的蛋白样本相关，麻烦您根据经验选择合适稀释倍数。
同时，不同的抗体可能需要在抗体稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20来降低背景，您可以根据您要检测的蛋白以及平时操作经验来选择需否在一抗稀释液中添加0.1-0.2%的Tween-20。
13.之后用PBST于摇床洗膜4×5mins。
14.封闭液稀释二抗（建议比例为1：3000~10000），膜在二抗中室温于摇床1hour（避光）。
注：如果一抗稀释液中含有0.1-0.2%的Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的Tween-20。
如果使用Tween-20的同时添加0.01-0.02%的SDS于二抗稀释液中可以比较好的降低背景15.洗膜同13（避光）16.用PBS洗去膜上残留的Tween-20，接下来可直接进行扫描。
实验的详细的操作流程、注意事项、问题解决请参见附件以及《分子克隆实验指南》。
仪器的操作流程：1．在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。
2．用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。
3．将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。
4．双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。
5．点击scan快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，开始扫描。
6．扫描结束后对扫描结果进行分析。
7．依次进行图象裁切、定道、定分子量标准、背景扣除等操作。
8．根据需要输出图形或数据报告表格。
七．软件使用培训以下是关于Odyssey配套软件的简要操作说明，便于初次操作的研究者能快速掌握如何使用软件进行扫描。
关于进一步的如何使用软件对实验结果进行分析，请参见随机所带的英文原版使用手册。
1．扫描操作流程1）打开软件，点击“File”栏中的“New”创建一个新项目（如果是在已有项目中添加新内容，则点击“File”栏中的“Open”，打开已有项目）2）在窗口“New Project”中设定项目文件存储的路径和项目名称3）点击“Scan”按钮创建该新项目4）在登陆窗口输入用户名和密码5）点击“OK”按钮，进入扫描控制窗口6）在“Name”栏输入该次扫描的名称7）在“Group”栏选择用户所属的组8）在“Preset”栏选择目前进行扫描的介质（eg：膜还是胶？）9）选择合适的分辨率，扫描质量和焦距（对于膜来说，一般选择分辨率为169，扫描质量为medium，焦距为0，假如是胶，焦距为胶厚度的1/2）10）在“Channels”栏根据所用二抗标记的荧光选择合适的通道，700或800或两者皆选，每个通道的激光强度可分别在“Intensity”栏调节11）扫描控制窗口的右下侧矩形框为扫描区域，根据待扫描的膜的位置调节红色矩形框，使其将膜的区域完全覆盖（注意：膜或胶一般均放置在扫描平面的左下方）。
12）扣上舱盖开始扫描13）点击“Alter Intensity”按钮可以根据需要分别调节两个通道的亮度，对比度和灵敏度，调节好后点击“OK”按钮确认14）扫描结束后会弹出一个“New Analysis”窗口，在“Name”栏输入Original Analysis，点击“OK”将未做更改的原始图片保存2．如何中止扫描要提前中止扫描过程，可以点击扫描控制窗口中的“Stop”按钮或者连续按两次扫描仪面板上的“Stop”键，此时扫描图像文件会被关闭并被保存下来，假如不希望将图象保存，点击扫描控制窗口中的“Cancel”按钮而非“Stop”按钮。
八.常见问题处理。