特殊毒性试验PPT课件

遗传毒性试验：
指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受 试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤 的固定 。
遗传毒性试验的用途：
主要用于致癌性预测。
遗传毒性试验的目的：
预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品 上市后使用人群的用药风险。
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药物的遗传毒性研究
基因型鉴定
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肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导：
多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.
（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆
上清即为S9。
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
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试验方法 （标准平皿掺入法）：
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg
苯妥英钠 2mg
小鼠 50mg
人与动物比值
5-2.5 2 4.8 10-2.5
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药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
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药物的遗传毒性
顶层琼脂＋测试菌株、 受试物、S9混合液
底层琼脂培养基平皿
（点试法）：
固化
37 ℃，培养48h
结果评价：
Rt/Rc≥2，并有量效关系，判为阳性； 滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。
菌落计数
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2.哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
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细胞:
CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。
建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期检查核型和有无支原 体等污染。-80℃或液氮冻存
药物作用时间: 药物和细胞接触非活化组作用24h和48h 收获细胞, 代谢活化组作用6小时以上
标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和 48h收获细胞（在1.5个细胞周期时收获细胞，若为阴性结果，作用时
间可大于1.5个细胞周期)
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（2）读片分析：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录染色
遗传毒性和致突变：联系、区别
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目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样， 可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外 进行添加或不添加代谢活化物质的试验，也可在整体动物上 进行体内试验
分类：
根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类:
•基因突变 •染色体畸变 •DNA损伤与修复
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导 剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
S9混合液：
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正向突变
鼠伤寒沙门菌His+
（野生型）
回复突变
鼠伤寒沙门菌His－ （突变型）
S9混合物 受试物
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试验菌株：
TA97、TA98、TA100和TA102
剂量设计：
（1）受试物至少应有5个剂量。 （2）最低剂量：1g/皿或0.1 g/皿
从试验系统来分: 体内试验 体外试验
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遗传毒性试验方法分类：
检测终点
微生物回复突变试验 基因突变 哺乳动物培养细胞基因突变试验
果蝇伴性隐性致死试验 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
染色体畸变 啮齿类动物微核试验 啮齿类动物显性致死试验 精原细胞染色体畸变试验 程序外DNA合成试验
DNA损伤与修复 姐妹染色单体交换试验 SOS显色试验
（3）最高剂量： 可溶、无毒：5mg/皿 可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿 难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿 难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显 （DMSO或者乙醇） 已知致突变原——阳性对照
菌株鉴定 组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定 uvrB缺失的鉴定 R因子鉴定
体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型
包括：染色体有无断裂、缺失、互换和裂隙 多倍体的出现
结果判定：
细胞畸变率＝有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数×100
细胞畸变率
结果判断
﹤5％
阴性（－）
5～10％
可疑（±）
10～20％
弱阳性（＋）
20～50％
中度阳性（＋＋）
﹥50％
强阳性（＋＋＋）
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遗传毒性研究（Genotoxicity Study） 是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他 毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有 着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重 要环节。
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点 等因素考虑进行遗传毒性试验。
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药物的遗传毒性研究
剂量：
高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，最高不要超过10mM 分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释 法。至少３个剂量
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对照：
阴性对照——溶剂 阳性对照——已知致突变剂
Ｓ９对照:
代谢活化：肝微粒体酶S9系统,应用诱导剂处理
后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验
时间：
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药物的遗传毒性研究
推荐的标准试验组合：
（1）一项体外细菌基因突变试验。
（2）一项用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评 估试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验。
（3）一项用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体 损伤试验。
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1.鼠伤寒沙门菌回复突变试验
微生物回复突变试验
原理
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组 氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物 存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落， 据此判断受试物是否为致突变物。
•注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变2试6 验
药物毒理学
药物特殊毒性研究
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药物特殊毒性研究
目的和意义：
研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、 衰老及畸胎等
特点：
特殊毒性试验存在着种属差异性：
定性差异 定量差异
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定性差异
• 反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少 对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家狗、３ 种田鼠和８种灵长类动物不致畸
• 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致 畸
• 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸 • 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却
引起脸和内脏畸形
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定量差异
致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显
表 人类与动物致畸剂量比较
药物 最低致畸剂量（/kg/d)
人
动物
反应停 0.5-1.0mg 兔 2.5mg