特殊毒性试验PPT课件
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新药药理学：特殊毒性试验
皮肤光毒性试验
光毒性反应指药物吸收的紫外光能量在皮 肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或 全身接触或应用化学物质后，继而暴露在 紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应
临床表现与晒伤相似：红斑、水肿、皮肤 瘙痒、色素沉着，甚至局部坏死、溃烂或 表皮脱落
皮肤光毒性试验
试验动物：成年白色豚鼠 试验分组：设阴性、阳性（8-甲氧基补骨脂素） 对照及受试物不同剂量组 试验前24h，将脊柱两侧皮肤去毛，2x2cm2 涂敷相应药物30min后，一侧用铝箔覆盖，一侧 用UVA照射 根据评分标准判定皮肤反应 1只或以上动物皮肤反应分值≥2，受试物具有光 毒性
溶血性试验
❖ 溶血性试验：观察受试物是否能够引起 溶血和红细胞凝聚等反应
❖ 凡注射剂和可能引起免疫性或非免疫性 溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血 性试验
溶血性试验
❖ 制备血红细胞悬液，加入受试物，充分混匀 后观察：
红细胞全部下沉，上清液体无色透明，说明无溶 血
溶液呈澄明红色，管底无细胞或有少量红细胞残 留，表明有溶血发生
眼刺激性试验
眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行 眼刺激性试验 首选家兔，可采用同体左右侧自身对比法 试验前24h需检查动物双眼 每只眼睛滴入0.05~0.1ml或涂敷0.1g受试物 给药后1、2、4、24、48及72h进行眼部检查 持久性损伤需延长观察期限，一般不超过21d 采用裂隙灯进行眼部检查，记录眼部反应分值， 判断刺激程度
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
(医学课件)局部毒性试验PPT幻灯片
任立群
一次给药 多次给药
3
娄宜嘉第二版《药物毒理学》——局部毒性试验
第一节 皮肤用药的毒性研究 第二节 眼用药刺激性试验
皮肤用药的急性毒性试验 皮肤用药的长期毒性试验 皮肤用药的刺激试验 皮肤吸收试验 皮肤光敏试验 皮肤过敏试验
第三节 肌内注射用药局部刺激性试验
第四节 静脉给药局部刺激性试验
第五节 滴鼻剂和吸入剂的毒性试验
角质层
透明层
表 皮
颗粒层
屏
棘层
障
基底层
基膜
真皮层内毛细血管
2019/5/31
11
第一节 皮肤毒性试验
● 药物经皮肤吸收的两条途径
(1) 通过表皮屏障而被吸收 (2) 通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器吸收
2019/5/31
12
第一节 皮肤毒性试验
● 药物经皮肤吸收的两条途径
(1) 通过表皮屏障而被吸收 (2) 通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器吸收
第一节 皮肤毒性试验
表皮层
真皮乳头层
真皮网织层
真皮层
8
2019/5/31
第一节 皮肤毒性试验
表皮角化层的差别
人类不同部位皮肤角化层的差别很大， 这些差别影响药物的经皮吸收。
足底和手掌的角化层坚硬而厚，约 400~600μm 位于臂、背、腿和腹部的皮肤仅 8~15μm 阴囊皮肤最薄
9
2019/5/31
若药物剂量超过有效浓度20 倍以上，仍 未出现异常或死亡，则只设一个高剂量组。
2019/5/31
20
一 皮肤急性毒性试验
第一节 皮肤毒性试验
[给药方法] 药物是膏剂或液体一般不稀释，
可直接试验，若药物是固体粉末则需用适当水或适 宜赋形剂（ 如羊毛脂、凡士林、橄榄油等）混匀， 以保证药物与皮肤良好的接触。
一次给药 多次给药
3
娄宜嘉第二版《药物毒理学》——局部毒性试验
第一节 皮肤用药的毒性研究 第二节 眼用药刺激性试验
皮肤用药的急性毒性试验 皮肤用药的长期毒性试验 皮肤用药的刺激试验 皮肤吸收试验 皮肤光敏试验 皮肤过敏试验
第三节 肌内注射用药局部刺激性试验
第四节 静脉给药局部刺激性试验
第五节 滴鼻剂和吸入剂的毒性试验
角质层
透明层
表 皮
颗粒层
屏
棘层
障
基底层
基膜
真皮层内毛细血管
2019/5/31
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第一节 皮肤毒性试验
● 药物经皮肤吸收的两条途径
(1) 通过表皮屏障而被吸收 (2) 通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器吸收
2019/5/31
12
第一节 皮肤毒性试验
● 药物经皮肤吸收的两条途径
(1) 通过表皮屏障而被吸收 (2) 通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器吸收
第一节 皮肤毒性试验
表皮层
真皮乳头层
真皮网织层
真皮层
8
2019/5/31
第一节 皮肤毒性试验
表皮角化层的差别
人类不同部位皮肤角化层的差别很大， 这些差别影响药物的经皮吸收。
足底和手掌的角化层坚硬而厚，约 400~600μm 位于臂、背、腿和腹部的皮肤仅 8~15μm 阴囊皮肤最薄
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若药物剂量超过有效浓度20 倍以上，仍 未出现异常或死亡，则只设一个高剂量组。
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一 皮肤急性毒性试验
第一节 皮肤毒性试验
[给药方法] 药物是膏剂或液体一般不稀释，
可直接试验，若药物是固体粉末则需用适当水或适 宜赋形剂（ 如羊毛脂、凡士林、橄榄油等）混匀， 以保证药物与皮肤良好的接触。
药物特殊毒性评价ppt课件
人类基因库是指人群生殖细胞所具有的能传给下一代的 全部基因总和。 基因组是指单一个体所具有全部基因 在人群中每个个体新携带的有害基因的平均水平叫做人 群的遗传负荷（Genntic load）或突变负荷（mutation
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
毒理学
一般毒性评价 特殊毒性评价 遗传毒性 致癌性 生殖毒性 依赖性
急性毒性
长期毒性
局部毒性
目 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 的 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护
措施、保证受试者用药安全
先天愚型海豹肢畸形 第1节 药物致遗传损伤的类型
突变（mutation）指生物体遗传物质发生急剧的遗 传学变化，导致可遗传的表型变异，其表型变异为不 可逆的，这种现象称为突变作用。
突变后果
生殖细胞突变的后果 致死性的 非致死性的-----遗传病（显性或隐性） 在遗传疾病增多的同时，突变的基因（及染色体） 损伤将造成下一代的基因库的遗传负荷
可遗传的突变都是坏事？
第4节 药物遗传毒性评价
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
毒理学
一般毒性评价 特殊毒性评价 遗传毒性 致癌性 生殖毒性 依赖性
急性毒性
长期毒性
局部毒性
目 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 的 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护
措施、保证受试者用药安全
先天愚型海豹肢畸形 第1节 药物致遗传损伤的类型
突变（mutation）指生物体遗传物质发生急剧的遗 传学变化，导致可遗传的表型变异，其表型变异为不 可逆的，这种现象称为突变作用。
突变后果
生殖细胞突变的后果 致死性的 非致死性的-----遗传病（显性或隐性） 在遗传疾病增多的同时，突变的基因（及染色体） 损伤将造成下一代的基因库的遗传负荷
可遗传的突变都是坏事？
第4节 药物遗传毒性评价
药物毒理学实验演示课件
350 ~ 1050克 >1050克
6. 注意事项
6.1 正确捉拿小白鼠，防止咬伤；
6.2 注意肌肉注射方法，给药剂量力求准确；
二. 实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法， 根据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一 次或24h后，观察动物所产生的警醒毒性反应及其严 重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计 算半数致死量（LD50）。据此分析受试动物毒性反应 与剂量的关系，并根据LD50值对药物进行毒性分级。
表2：结果记录表
组别
注射浓度（mg/kg）
Hale Waihona Puke 动物数 死亡数 死亡率备注
1
1000
4
2
850
4
3
720
4
4
660
4
5
520
4
4. 计算LD50
4.1计算方法：目测机率单位法、加权机率单 位法(Bliss 法)、寇氏法、序贯法。
4.2 Bliss 法是目前推荐使用的方法。此法对 剂量分组无严格要求，不需要剂量组有0%和 100%死亡率，是目前公认最准确的测定方法。
安全范围 是指药物的最小有效量与最小中毒量之间的范围，它表示药 物的安全性，一般安全范围越大，用药越安全。药理学用上95%有效剂量 （ED95）到5%中毒剂量（LD5）的距离来表示。
实验一 急性毒性试验
• （一） 药物LD50的测定
一、实验目的
（1）理念——是药三分毒; （2）了解一些常规药物毒理学的试验方法， 及评价指标; （3）掌握药物急性毒性试验的试验设计方 法、LD50的测定及计算方法。
亚慢性毒性 是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出 现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。“多日”的确 切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学 中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。
6. 注意事项
6.1 正确捉拿小白鼠，防止咬伤；
6.2 注意肌肉注射方法，给药剂量力求准确；
二. 实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法， 根据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一 次或24h后，观察动物所产生的警醒毒性反应及其严 重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计 算半数致死量（LD50）。据此分析受试动物毒性反应 与剂量的关系，并根据LD50值对药物进行毒性分级。
表2：结果记录表
组别
注射浓度（mg/kg）
Hale Waihona Puke 动物数 死亡数 死亡率备注
1
1000
4
2
850
4
3
720
4
4
660
4
5
520
4
4. 计算LD50
4.1计算方法：目测机率单位法、加权机率单 位法(Bliss 法)、寇氏法、序贯法。
4.2 Bliss 法是目前推荐使用的方法。此法对 剂量分组无严格要求，不需要剂量组有0%和 100%死亡率，是目前公认最准确的测定方法。
安全范围 是指药物的最小有效量与最小中毒量之间的范围，它表示药 物的安全性，一般安全范围越大，用药越安全。药理学用上95%有效剂量 （ED95）到5%中毒剂量（LD5）的距离来表示。
实验一 急性毒性试验
• （一） 药物LD50的测定
一、实验目的
（1）理念——是药三分毒; （2）了解一些常规药物毒理学的试验方法， 及评价指标; （3）掌握药物急性毒性试验的试验设计方 法、LD50的测定及计算方法。
亚慢性毒性 是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出 现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。“多日”的确 切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学 中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。
《动物毒理学》课件：第六章 特殊毒性作用
❖ 1968年，日本上野制药公司合成出AF2 ❖ 高效杀菌的新型硝基类化合物 ❖ 当时称为：划时代食品防腐剂
❖ 通过了大阪大学医学系病理学教研室的急、慢性 毒性试验
❖ 厚生省的批准，商品化，广泛应用了几年 ❖ 1973年的9月，第二次日本环境诱变剂会上，认为
AF2有遗传毒性 ❖ 1974年8月证实了具有致癌性，禁止 ❖ 专家：即使禁止使用10年后，日本人的消化器官
基因突变（1）——碱基置换
❖ 碱基替换：指DNA分子中一个碱基被另 一个不同的碱基所替换。
转换：嘌呤 颠换：嘌呤
嘌呤，嘧啶 嘧啶
嘧啶
1) 同义突变
同义突变 (Synonymous mutation)：由于密码子 具有兼并性，单个碱基置换后密码子所编码的是同 一种氨基酸 ，表型不改变。
亮氨酸
❖ 正常 AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
事件
作者
发现X射线可以改变生殖细胞的 DeVries 遗传物质
用X射线照射果蝇发现可以引起 Muller 基因突变
发现芥子气可诱发基因和染色体 Averbach &
畸变
Robson
用X射线可诱发小鼠突变
化学物可诱发小鼠突变
Russed
成立国际环境诱变剂学会
Guttanach
例：日本新型食品防腐剂AF2
❖ 同义突变 AGT CAG CAG CAG TTT TTG CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
2) 错义突变
错义突变 (Missense mutation)：DNA分子中的碱 基置换后，形成新的密码子，从而导致所编码的氨 基酸发生改变，产生活性降低、无活性或无功能的 蛋白质。
❖ 通过了大阪大学医学系病理学教研室的急、慢性 毒性试验
❖ 厚生省的批准，商品化，广泛应用了几年 ❖ 1973年的9月，第二次日本环境诱变剂会上，认为
AF2有遗传毒性 ❖ 1974年8月证实了具有致癌性，禁止 ❖ 专家：即使禁止使用10年后，日本人的消化器官
基因突变（1）——碱基置换
❖ 碱基替换：指DNA分子中一个碱基被另 一个不同的碱基所替换。
转换：嘌呤 颠换：嘌呤
嘌呤，嘧啶 嘧啶
嘧啶
1) 同义突变
同义突变 (Synonymous mutation)：由于密码子 具有兼并性，单个碱基置换后密码子所编码的是同 一种氨基酸 ，表型不改变。
亮氨酸
❖ 正常 AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
事件
作者
发现X射线可以改变生殖细胞的 DeVries 遗传物质
用X射线照射果蝇发现可以引起 Muller 基因突变
发现芥子气可诱发基因和染色体 Averbach &
畸变
Robson
用X射线可诱发小鼠突变
化学物可诱发小鼠突变
Russed
成立国际环境诱变剂学会
Guttanach
例：日本新型食品防腐剂AF2
❖ 同义突变 AGT CAG CAG CAG TTT TTG CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
2) 错义突变
错义突变 (Missense mutation)：DNA分子中的碱 基置换后，形成新的密码子，从而导致所编码的氨 基酸发生改变，产生活性降低、无活性或无功能的 蛋白质。
特殊毒性实验
哺乳动物 长期致癌试验
长期致癌试验常规选用大鼠和 小鼠，刚离乳的实验动物。设 三个试验组。以最大耐受剂量 （MTD）为高剂量。原则上试验 期限要求长期或终生，一般小 鼠 1.5 年，大鼠 2 年。观察有无 肿瘤出现、肿瘤出现时间及死 亡时间。
(三) 特殊毒性试验
第二节：致癌试验
动物 选择 剂量 分组 途径 期限 结果 分析
大鼠全 胚培养
器官 培养
胚胎细胞 微团培养
水螅 培养
(三) 特殊毒性试验
三段生殖毒性试验
Ⅰ段 Ⅱ段 Ⅲ段
一般生殖毒性试验
致畸试验
围生期毒性试验
（出生后发育）
（生育力和早期胚胎发育） （胚体-胎体）
参考资源
(三) 特殊毒性试验
小鼠骨髓细胞微核试验
Break or loss
(三) 特殊毒性试验
小鼠骨髓细胞微核试验
(三) 特殊毒性试验
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
(三) 特殊毒性试验
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
(三) 特殊毒性试验
第二节：致癌试验
哺乳动物细胞 体外恶性转化试验
体外细胞转化试验是检测受试 物对体外培养的哺乳动物细胞 转化的遗传毒理试验。是将动 物细胞在体外培养的环境下， 将细胞暴露于致癌物，高度模 拟致癌物在体内致癌的作用进 行致癌物检测的一种技术，可 以有效的体外筛查致癌物质的 致癌活性。
传统实验 体外筛选试验 三段生殖毒性试验
(三) 特殊毒性试验
传统实验
动物 选择 剂量 分组 动物 交配 胎仔 检查
结果 评定
大 鼠 家 兔
3剂量组 每组受孕 雌性动物 15-20只
1:1或1:2 大鼠第6天 给受试物 持续到第 15天
A特殊毒性实验_PPT幻灯片
尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在 致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。
2、哺乳动物细胞基因突变试验
62
体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加 入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露 于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突 变细胞在含有6—硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性 培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落 数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突 变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的 比值。
移码突变。
35
（一）以DNA为靶的直接诱变
（3）碱基类似物的（base analogue）取代 取代后的碱基类似物出现异构互变,发生错误配对而造成碱基置换。 例如：5-溴脱氧尿嘧啶（5-BU）取代T，2- 氨基嘌呤（2-AP）取代G。
36
37
胸腺嘧啶
38
（一）以DNA为靶的直接诱变
（4）改变或破坏碱基化学结构
修复过程中的酶
复制 46
47 切除修复
§4 突变的后果
体细胞突变
仅影响接触致突变物 的个体，不影响下一 代。
肿瘤、畸形、动脉粥 样硬化、糖尿病及衰 老等。
48
生殖细胞突变 可影响下一代，甚至
人类的基因。 基因突变对人类的影
响程度分为五类。
49
① 对机体无影响，如同义突变； ② 导致对健康无影响的正常人体生化组成的遗传学变异； ③ 导致遗传易感性的改变； ④ 导致遗传性疾病； ⑤ 致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。
55
（1）什么是细菌回复突变试验？ 以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体
外试验。 常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸
营养缺陷型的大肠杆菌。
2、哺乳动物细胞基因突变试验
62
体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加 入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露 于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突 变细胞在含有6—硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性 培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落 数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突 变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的 比值。
移码突变。
35
（一）以DNA为靶的直接诱变
（3）碱基类似物的（base analogue）取代 取代后的碱基类似物出现异构互变,发生错误配对而造成碱基置换。 例如：5-溴脱氧尿嘧啶（5-BU）取代T，2- 氨基嘌呤（2-AP）取代G。
36
37
胸腺嘧啶
38
（一）以DNA为靶的直接诱变
（4）改变或破坏碱基化学结构
修复过程中的酶
复制 46
47 切除修复
§4 突变的后果
体细胞突变
仅影响接触致突变物 的个体，不影响下一 代。
肿瘤、畸形、动脉粥 样硬化、糖尿病及衰 老等。
48
生殖细胞突变 可影响下一代，甚至
人类的基因。 基因突变对人类的影
响程度分为五类。
49
① 对机体无影响，如同义突变； ② 导致对健康无影响的正常人体生化组成的遗传学变异； ③ 导致遗传易感性的改变； ④ 导致遗传性疾病； ⑤ 致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。
55
（1）什么是细菌回复突变试验？ 以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体
外试验。 常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸
营养缺陷型的大肠杆菌。
药物毒理学实验演示课件
评价一个药物的毒性指标：安全剂量（safety dose）、最小中 毒剂量（minimal toxic dose）、最大耐受剂量（MTD）、半数致死 量（LD50）、治疗指数（TI=LD50/ED50）、安全范围（MS=LD1/ED99或 LD5/ED95）
急性毒性试验 是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的 第一步。要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经 口、吸入或经皮染毒途径。急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度）， 观察急性中毒表现，
特殊毒性试验 包括致畸、致癌、致突变作用以及生殖毒性试验。 （1）致突变实验包括微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 和整体试验（常选用微核试验）。 作用于生殖系统的药物， 需进行动物显性致 死试验。 （2） 致癌实验： 短期致癌实验和长期致癌实验。 （3） 致畸胎试验：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期给药，观察对子代的影响。
三、实验材料
1、动物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，与给受试物24 小时将动物背部脊柱两侧毛脱掉，脱毛面积约为体表面积1０ ％（家兔每侧各约50cm2）。
2、受试物：膏剂、液体或粉末。粉末需用适宜赋形剂（如 羊毛脂、凡士林等）混匀，本实验采用10%双氧水溶液。
四、实验方法
1、实验操作：在家兔背部受试物区和对照区（脱毛后），一 次将受试物1ml均匀涂布受试物区，将生理盐水涂布于空白对 照区，再以医用纱布及胶布进行包扎固定，开始计时。在给 药后30分钟取下包扎，用温水洗净皮肤上的残留受试物，观 察受试区皮肤的变化，有无红斑、水肿等现象。
也叫卫星核,是真核类生物细胞中的一种异常结 构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进 入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色 单体或染色体的无着丝粒片断或环。最后单独形成 一个或几个规则的次核，存在于细胞质中，由于比 核小得多故称微核。
急性毒性试验 是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的 第一步。要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经 口、吸入或经皮染毒途径。急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度）， 观察急性中毒表现，
特殊毒性试验 包括致畸、致癌、致突变作用以及生殖毒性试验。 （1）致突变实验包括微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 和整体试验（常选用微核试验）。 作用于生殖系统的药物， 需进行动物显性致 死试验。 （2） 致癌实验： 短期致癌实验和长期致癌实验。 （3） 致畸胎试验：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期给药，观察对子代的影响。
三、实验材料
1、动物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，与给受试物24 小时将动物背部脊柱两侧毛脱掉，脱毛面积约为体表面积1０ ％（家兔每侧各约50cm2）。
2、受试物：膏剂、液体或粉末。粉末需用适宜赋形剂（如 羊毛脂、凡士林等）混匀，本实验采用10%双氧水溶液。
四、实验方法
1、实验操作：在家兔背部受试物区和对照区（脱毛后），一 次将受试物1ml均匀涂布受试物区，将生理盐水涂布于空白对 照区，再以医用纱布及胶布进行包扎固定，开始计时。在给 药后30分钟取下包扎，用温水洗净皮肤上的残留受试物，观 察受试区皮肤的变化，有无红斑、水肿等现象。
也叫卫星核,是真核类生物细胞中的一种异常结 构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进 入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色 单体或染色体的无着丝粒片断或环。最后单独形成 一个或几个规则的次核，存在于细胞质中，由于比 核小得多故称微核。
新药药理学：特殊毒性试验
❖ 替代试验：给予动物各类代表药如吗啡、巴比妥钠 等，使之产生身体依赖性后，停止给予代表药，以 同样方式给予不同剂量受试药，观察记录动物替代 期间戒断行为和体重变化
药物依赖性试验
❖ 催促试验：在短时间给予动物大剂量受试药，然后 注射受体对抗剂观察和记录是否出现戒断症状及其 严重程度。此法只适用于有竞争对抗剂的阿片类药 物
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
❖ 诱导试验：大部分镇静催眠药无竞争性受体对抗剂， 可采用诱导试验。通过应用各种诱发惊厥的方法， 只采用阈下刺激强度，对正常动物不引起惊厥反应， 对镇静催眠药产生依赖性的动物，在断药期间出现 反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥
药物依赖性试验
❖ 镇痛药：自然戒断/替代试验以及催促试验 ❖ 镇静催眠药：自然戒断/替代试验以及诱导试
药物依赖性
❖ 依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性
❖ 躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所产 生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症 状
❖ 精神依赖性是药物对中枢神经系统作用所产生的一 种特殊的精神效应，表现为对药物的强烈渴求和强 迫性觅药行为
身体依赖性试验
❖ 自然戒断试验：连续给予动物一段时间的受试药后， 突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的代 表药物做对比，按照戒断症状和严重程度判断受试 药的依赖性潜力
药物依赖性试验
❖ 催促试验：在短时间给予动物大剂量受试药，然后 注射受体对抗剂观察和记录是否出现戒断症状及其 严重程度。此法只适用于有竞争对抗剂的阿片类药 物
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
❖ 诱导试验：大部分镇静催眠药无竞争性受体对抗剂， 可采用诱导试验。通过应用各种诱发惊厥的方法， 只采用阈下刺激强度，对正常动物不引起惊厥反应， 对镇静催眠药产生依赖性的动物，在断药期间出现 反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥
药物依赖性试验
❖ 镇痛药：自然戒断/替代试验以及催促试验 ❖ 镇静催眠药：自然戒断/替代试验以及诱导试
药物依赖性
❖ 依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性
❖ 躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所产 生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症 状
❖ 精神依赖性是药物对中枢神经系统作用所产生的一 种特殊的精神效应，表现为对药物的强烈渴求和强 迫性觅药行为
身体依赖性试验
❖ 自然戒断试验：连续给予动物一段时间的受试药后， 突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的代 表药物做对比，按照戒断症状和严重程度判断受试 药的依赖性潜力
特殊毒性试验PPT课件
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导 剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
S9混合液：
13
14
正向突变
鼠伤寒沙门菌His+
（野生型）
回复突变
鼠伤寒沙门菌His－ （突变型）
S9混合物 受试物
15
试验菌株：
TA97、TA98、TA100和TA102
剂量设计：
（1）受试物至少应有5个剂量。 （2）最低剂量：1g/皿或0.1 g/皿
基因型鉴定
17
肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导：
多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.
（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆
上清即为S9。
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
18
试验方法 （标准平皿掺入法）：
（3）最高剂量： 可溶、无毒：5mg/皿 可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿 难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿 难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过5mg/皿
16
对照设置 溶剂——阴性对照 （DMSO或者乙醇） 已知致突变原——阳性对照
菌株鉴定 组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定 uvrB缺失的鉴定 R因子鉴定
39
不适用受试物
用于晚期全身肿瘤的抗肿瘤药物，通常不需要进行致癌试验。 对于替代治疗的内源性物质（浓度在生理水平），尤其是 当同类产品（如动物胰岛素、垂体来源的生长激素和降钙素） 已有临床使用经验时，通常不需要进行致癌试验 系统暴露量非常小的局部用药不需要以经口给药途径来评价 其对内脏器官的潜在致癌作用，若有潜在光致癌性担忧， 可能需要进行皮肤给药致癌试验。 除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常 不需要进行致癌试验 有致癌潜在，但是短期接触或非经常使用药物（麻醉/放射） 经化学合成、从动物或人体组织中提取纯化或生物技术方法 （如重组DNA技术）生产的内源性肽类或蛋白质及其类似物， 可能需要特殊考虑。
S9混合液：
13
14
正向突变
鼠伤寒沙门菌His+
（野生型）
回复突变
鼠伤寒沙门菌His－ （突变型）
S9混合物 受试物
15
试验菌株：
TA97、TA98、TA100和TA102
剂量设计：
（1）受试物至少应有5个剂量。 （2）最低剂量：1g/皿或0.1 g/皿
基因型鉴定
17
肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导：
多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.
（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆
上清即为S9。
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
18
试验方法 （标准平皿掺入法）：
（3）最高剂量： 可溶、无毒：5mg/皿 可溶、有毒：显示明显毒性，但不超过5mg/皿 难溶、无毒：产生沉淀的最低浓度，但不超过5mg/皿 难溶、有毒：多个产生沉淀的浓度，显示明显毒性，不超过5mg/皿
16
对照设置 溶剂——阴性对照 （DMSO或者乙醇） 已知致突变原——阳性对照
菌株鉴定 组氨酸营养缺陷鉴定 深粗糙型鉴定 uvrB缺失的鉴定 R因子鉴定
39
不适用受试物
用于晚期全身肿瘤的抗肿瘤药物，通常不需要进行致癌试验。 对于替代治疗的内源性物质（浓度在生理水平），尤其是 当同类产品（如动物胰岛素、垂体来源的生长激素和降钙素） 已有临床使用经验时，通常不需要进行致癌试验 系统暴露量非常小的局部用药不需要以经口给药途径来评价 其对内脏器官的潜在致癌作用，若有潜在光致癌性担忧， 可能需要进行皮肤给药致癌试验。 除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常 不需要进行致癌试验 有致癌潜在，但是短期接触或非经常使用药物（麻醉/放射） 经化学合成、从动物或人体组织中提取纯化或生物技术方法 （如重组DNA技术）生产的内源性肽类或蛋白质及其类似物， 可能需要特殊考虑。
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23
第二节 化学致癌物的分类
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24
化学致癌物的分类
➢ 组1，对人类是致癌物，87种； ➢ 组2，对人类是很可能或可能致癌物
❖ 组2A，对人类很可能是致癌物，63种； ❖ 组2B，对人类是可能致癌物，234种； ➢ 组3，现有证据不能对人类致癌性进行分类， 493种； ➢ 组作用的化学物质，称为促长剂 (promotor)
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18
3．进展阶段 在促进之中或之后， 细胞表现出不可逆的遗传 学改变，其标志为遗传不 稳定性增加和恶性变化， 在形态上或功能代谢和行 为方面逐渐表现出肿瘤的 特征，如生长速度、侵袭 性、转移能力及生化、免 疫性能改变
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分化 程度
高
低 表皮干细胞的分化
抑癌基因对细胞的生长、增殖和分化 起负调节作用，即抑癌作用
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12
抑癌基因正常时可抑制肿瘤细胞的肿 瘤性状的表达。当其自身不能表达或其产 物去活化才允许肿瘤性状的表达
正常细胞转化为肿瘤细胞最少涉及两类 基因的遗传学改变，即癌基因和抑癌基因 的改变
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（四）基因表达调控异常与肿瘤发生
➢ 基因学说：癌变是由于基因的改变 ➢ 基因外学说：基因表达调控失常 ➢ 理论统一
化学、物理或生物等致癌因素作用于细胞 后，引起原癌基因突变使之激活，转变成癌 基因后才会导致细胞癌变
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2．抑癌基因 (anti-oncogene)
正常细胞分裂生长的负性调节因子， 其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂 活性，或称为肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)、肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene)
➢ 间接致癌物（indirect careinogens）：在 体内经代谢转化，其产物具致癌作用
➢ 无机致癌物：亲电子剂或通过选择性改 变DNA复制保真性，导致DNA的改变
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2．非遗传毒性致癌物 （epigenotoxic carcinogens）
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26
二、根据致癌物作用机制的分类
1．遗传毒性致癌物 （genotoxic carcinogens）
➢ 与DNA共价结合，引起机体遗传物质 改变，导致癌变的化学物质 ➢ 占化学致癌物的大多数 ➢ 可利用遗传毒理学试验来检测
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➢ 直接致癌物（direct careinogens）：在 体内不需要经过代谢活化即可致癌
引发剂（启动剂，initiator） 具有引发作用的化学物质
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2．促长阶段
促进引发形成肿瘤细胞分裂生长的作用阶段
➢ 引发物作用之后，促癌物长期、慢性作用 ➢ 引发物单独作用一般不会引起肿瘤 ➢ 只有促癌物的慢性作用不会引起肿瘤 ➢ 引发物与促长物的作用有先后次序 ➢ 引发作用不可逆，促长在早期可逆
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图8-1 多阶段致癌理论图解
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四、非遗传毒性致癌机制
➢ 部分致癌物用目前常用致突变试验不 能检出其致突变性
➢ 常见的非遗传毒性致癌物：石棉、激 素、免疫抑制剂、多氯联苯等
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非遗传毒性致癌机制
➢ 细胞间隙连接通讯 （gap junction intracellular communication，GJIC） ➢ 信号传导系统 ➢ 纺锤丝系统 ➢ DNA修复系统 ➢ 基因表达调控系统
➢ 错误修复，经修复的DNA部分仍可 能在结构和功能上有缺陷
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8
（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因
1．癌基因 (oncogene)
在自然或实验条件下具有诱发恶性转化 的潜在基因，是化学致癌物作用的主要靶分 子，在细胞癌变过程中起着关键作用
是一类被激活的基因，所指导合成的蛋 白质能够促成细胞恶性表型的形成
终致癌物
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5
前致癌物 (precarcinogen) 不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其
代谢产物才具致癌作用的化合物
近致癌物 (proximate carcinogen) 前致癌物经代谢活化过程形成一种或一
系列中间代谢产物，必须经进一步代谢活化， 才能形成终致癌物
终致癌物 (ultimate carcinogen) 直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所
致癌毒性试验
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1
肿瘤(tumor，neoplasm) ：有分裂潜能的细胞受 致癌因素作用后发生恶性转化和克隆性增生所 形成的新生物
良性肿瘤：呈膨胀生长，与周围组织有明显的 界限，多有包膜，它们生长常有“自限性”， 对机体破坏较小
恶性肿瘤：癌和肉瘤
癌(carcinoma)：由上皮细胞来源的恶性肿瘤
肉瘤(sarcoma)：由间质细胞来源的恶性肿瘤
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2
化学致癌物 (chemical carcinogen)
凡能引起动物和人类肿瘤、增加其发 病率或死亡率的化合物
化学致癌作用 (chemical carcinogenesis)
化学致癌物在体内引起肿瘤的过程
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3
第一节 化学致癌的机制
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4
一、与致癌作用有关的代谢
前致癌物
代谢酶 多态性
近致癌物
代谢酶 多态性
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15
三、化学致癌过程
➢ 引发阶段 (initiation) ➢ 促长阶段 (promotion) ➢ 进展阶段 (progression)
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1．引发阶段 / 启动阶段 突变细胞（启动细胞，initiated cell）
致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经 细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细 胞发生永久性、不可逆的遗传性改变
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原癌基因 (proto-oncogene)
机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传 信息。正常情况下它呈静止状态，对细胞 无害且具有重要生物学功能（调控细胞生 长分化，促进细胞分裂、增殖等）
原癌基因在进化过程中高度保守
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10
当发生突变、缺失、病毒整合、染色体 易位、基因扩增或促长剂插入时，原癌基因 发生改变，失去正常的调控细胞生长和分化 功能，使细胞发生恶性转化。发生恶性转化 的原癌基因即是癌基因
形成的具有致癌作用的代谢物的统称
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二、化学致癌作用的分子机制
（一）DNA加合物
有致癌活性的终致癌物，含有亲电子 结构基团的化合物，它能与细胞靶分子发 生共价结合，形成加合物使这些生物大分 子烷基化，导致DNA的突变
接触环境致癌物的标志
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7
（二）DNA修复与化学致癌
➢ 正确修复，使机体内受损的DNA完 全回复原有的结构和功能