酶活性及酪氨酸酶..

酶催化活性及其影响因素的研究

学院:化学与分子工程学院

班级:应用化学108班

姓名:王文移05 宁家彬06

指导老师:詹天荣

酶催化活性及影响其活性因素的研究

作者：王文移 宁家彬

[摘要]：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探

究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH 值，抑制剂对于酶活性的影响。

[关键词]：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH ，温度，抑制剂

Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different

concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity.

[引言]

认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性，是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。

酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。

1.实验原理

本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜色，多巴的吸光度。

本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。

由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。

酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过

下式可计算酶的活性：610⨯∆=ktV

A

a ，式中，a 为所用溶液的酶的活性，A ∆为

最大吸收波长吸光度的变化，t 为时间（min ），k 为多巴红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：m aV o /A 。式中A 为原料中酶的活性（注意此处A 不是吸光度A ），V 0为原料所得的酶溶液的总体积，m 为原料总质量。

淀粉在淀粉酶作用下发生分解，其变化为：淀粉——紫色糊精——红色糊精——麦芽糖，葡萄糖。

淀粉与糊精无还原性，对班氏试剂呈阴性；麦芽糖与葡萄糖则是还原性的糖，与班氏试剂共热生成红棕色氧化亚铜的沉淀。

反应最适温度为37-40o C ，最适pH 为6.8，Cl -离子是激活剂，Cu 2+离子是抑制剂。

下图为多巴在酪氨酸酶的催化作用的下的反应历程

2.实验仪器与试剂

1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表

2、试剂：二羟基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆、淀粉溶液，碘液、班氏试剂、盐酸、乳酸、碳酸钠、氯化钠、硫酸铜

3.实验步骤

3.1 酪氨酸酶的活性研究

3.1.1.溶液配制

0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.2）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+8ml

0.1mol/L盐酸，定容至200ml；

0.10mol/L磷酸缓冲溶液（pH=6.0）：50ml 0.20mol/L磷酸二氢钠+22ml

0.1mol/L盐酸，定容至200ml；

0.10mol/L多巴溶液：0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液定容至100ml （现用现配）。

3.1.2酶的提取

取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.0g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压，两层纱布滤出提取液，立即离心分离（3000rpm，

5min），倾出上层清液保存于冰浴中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。

3.1.3酶的活性测量

取2.5ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到10ml比色管中，摇匀

分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.5mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入2ml多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。

取0.2ml，0.3ml。0.4ml已稀释过提取液重复上述实验（总体积为5ml）。

以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。

3.2淀粉酶的活性研究

3.2.1.淀粉酶活性的检测：取一只试管加入5ml淀粉溶液和0.2-2ml唾液，混匀后水浴（37o C）在白瓷板上用碘液观察颜色，至微黄色为止，向上述试管中加入2ml班氏试剂，放入沸水中加热十分钟观察实验现象

3.2.2.pH对酶活性的影响：取四只试管分别加入盐酸，乳酸，蒸馏水，碳酸钠各2ml再加入2ml淀粉溶液和2ml酶溶液，37度水浴，5分钟后加入2ml班氏试剂，沸水浴，观察沉淀生成情况

3.2.3.温度对酶的影响：三只试管分别加入3ml淀粉，另外三只加1ml淀粉酶，分别成组在0，37，70度下水浴，5分钟后混合，5分钟后加碘液，观察颜色

3.2.

4.抑制剂与激活剂的作用

3.3影响酶活性的因素的研究

（1）取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。

（2）取0.40ml稀释过的提取液，加入少量的固体Na

2S

2

O

3

配成测定溶液，观

察现象。

（3）取0.40ml稀释过的提取液，加少量EDTA振动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。

4.实验数据记录及讨论

(一)酪氨酸酶催化活性研究

加入不同量的酶在不同时间反应的吸光度如下表（表1）所示，由于反应在8分钟以后已经趋于平缓，故在12分钟以后的两组（14、16）实验数据未列出。

表1：不同酶加入量不同时间反应的吸光度测定