石蜡切片技术 ppt课件

石蜡切片技术
为什么选择这一技术呢？主要因为它有 以下优点：便于推广、经济、适用、简
容易； 设备要求不高 ； 可长期保存； 染色容易，而且都能被染色，形成好的反
差和好的选择性。
石蜡切片技术
杀生（取材）——固定——冲洗——脱水— —保存——透明——石蜡透入——包埋—— 切片——复水——染色——脱水——封藏— —观察保存 （一）取材、固定、洗涤、脱水 （二）透明、透蜡、包埋 （三）切片、贴片 （四）染色、封藏
石蜡切片技术
石蜡切片技术
光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞 结构
由于组织太厚，光线很难穿过 压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，
看不到其他结构，因此需要切片变薄。 因细胞水多，太软，无法切片
鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代， 变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是 石蜡切片技术
石蜡切片技术
(1) 冲洗彻底——否则收缩、变硬、抽取 (2)不能时间太长太急——变软，肿胀（吸水） (3) 摇动有利于冲洗干净——加快分子运动
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1. 目的： 因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细 胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无 法让细胞变硬，无法进行切片。
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脱水剂的选择 原则：①凡与水和石蜡亲和性好的②且不使细胞剧烈收 缩膨胀，③不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。常 用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、 正丁醇等。
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1.目的： 为了使取样的细胞在形态结构和成分方面保
持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞避 免失水变形，自溶破坏结构等。 固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀； 软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期 保存等7项。
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（1）固定剂的种类：一般采用化学固定 单纯固定：只用一种试剂固定： 混合固定：用两种或两种以上的试剂混合在
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杀生（动物） 1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取
出所需组织。 3.注意事项：
性别合适 麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，
进而影响细胞结构 取材部位要准， 速度快
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1.目的：得到所需要的组织 2.方法：a.用剪刀剪下组织
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卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid) 适用于一般植物 组织和细胞的固定,常用于根尖,花药压片及子房石 蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定15— 20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超 过24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止; 如果材料不马上用,需转入70%酒精中保存.固定 液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维 持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的 嗜碱性，达到优良染色效果。
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F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适 用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物 形态解剖研究上应用极广;
FAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰 醋酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又 是细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免 疫组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强 大的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效果较差.
b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶液） 植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤损伤， 用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。
c.切成小块 3注意事项：
▪ 要准 ▪ 要快 ▪ 避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） 植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要 因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构， 同时发育程度、部位要准。
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静置固定：将组织块放入盛有固定液的小的 称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低 温（0~4℃）固定一段时间，不断摇动能增 加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。
灌注固定：常用于动物，将固定液通过已麻 醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细 胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现 象，但较繁琐。
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静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出 该液，加入新的冲洗液，反复几次（5~6次）， 每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始 一次为20~30分钟，以后几次可延长1~2h，） 具体时间与材料性质、大小和温度有关。
流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流 水冲洗，效果较静置冲洗为好，时间为 12~24h，但流水不能太大太急，也不能太长， 太长使组织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h 左右，如木本植物的木质部。
一起进行固定如：
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福尔马林formalin:10%的甲醛（37%—— 40%）
醋酸（0.3%~5%） 苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） 铬酸0.5~1% 锇酸1~2% 升汞（氯化汞饱和水溶液约7%）
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用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： 卡诺氏固定液
酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一般 组织细胞。 FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收 缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. 但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究
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固定条件的选择：种类、浓度、温度和时间 固定要快否则会自溶： 组织快，不能太多，否则固定不透：
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1.冲洗的目的 除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用，
固定时间太长，组织收缩变脆。
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⑴ 冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形变 提取，不反应，有效除去固定液。 ①固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲 洗； ② 固定液是酒精多以不同浓度的酒精冲洗， 以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度。 材料与酒精的比例一般为1：10（加入的体积） （70%乙醇换洗3次，每次20~60min ）