高通量测序技术在微生物多样性与功能研究方面的应用
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高通量测序技术在微生物多样性与功能研究方面的应用
一、高通量测序技术简介
进入21世纪,随着基因组计划的完成,人类进入后基因组时代,对测序技术的迫切需求,促使测序技术迅猛发展,进而形成第2代测序技术——高通量测序的时代。其中最具代表性的测序平台包括罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX Sequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLID Sequencer)。
1、Illumina Genome Analyzer和HiSeq 2000
IIllumina公司的新一代测序仪(包括CenomeA nalyzer及其升级版HiSeq 2000)利用基于单分子簇的边合成边测序技术(Sequencing by SynthesisSBS)和专有的可逆终止化学反应,可以在短时问内获得大量数据。测序特点:①通量高,目前一台机器在两周内最高可产出360 G的数据;②准确率高,≥98.5%,同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题;③成本低,低于传统Sanger测序技术成本的1%;④DNA序列的读取长度不断增加,当前单条序列读长可达到150 bp;⑤可以进行Pair-End(PE)双向测序,PE文库插入片段大小范围可由150 bp到10 kb。正确选择插入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装,这进一步扩展了该技术的应用范围。
2、Roche GS FLX Titanium System
2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统—Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了新一代测序技术的先河。测序特点:①速度快,一个测序反应耗时10 h,获得4-6亿个碱基对,比传统的Sanger测序的方法快100倍;②读长长,单条序列的读长平均可达到450 bp;③通量高,每个反应可以得到超过100万个序列读长;④准确度高,读长超过400 bp时,单一读长的准确性可以超过99%;⑤可以进行Pair-End测序研究。
3、AB SOLiD system
AB SOLiD sequencer是由ABI公司研发的新一代高通量基因测序分析系统,该技术以用四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础,能够对单拷贝扩增的DNA片段进行大规模高通量并行测序,根据双碱基编码原理进行数据比对。
测序特点:①可制备Mate-paired文库测序,插入片段范围600 bp一10 kb;②通量高,每台SOLiD4 System测序仪在15天内能够获得100 G的数据量;③采用Primer reset方式,保证了较低的噪音,失败的Round可以重做;④测序时采用连接反应,稳定性高,准确性高,有效地解决了多聚核苷酸序列困难读取的问题;⑤每个DNA碱基检测2次,这增加了序列读取的准确性。
二.高通量测序技术在转录组学研究中的应用实例
转录组学(transcriptomics),是一门在RNA水平上研究细胞中基因转录的整体情况及转录调控规律的学科。研究转录组最为广泛的方法是利用微阵列(microarray)技术检测有机体基因组中基因的表达。近年在微阵列技术基础上改进的瓦片阵列(tiling array)技术,使用了覆盖全基因组、相互交叠的探针,能够更精细的揭示RNA世界的状态和变化情况。该技术己经被成功应用到多种细菌的研究中。但除了存在背景干扰,饱和度,探针密度和质量等影响实验准确度的因素外,微阵列技术的最大缺点是无法进行de novo转录组研究。芯片探针设计要倚赖于己有的参考基因组序列,不能发现每株菌特有的转录序列以及这些序列的表达水平变化。而使用RNA-seq方法,对全基因组cDNA进行高通量测序,可以从根本上解决这个问题。
2009年,Yoder-Himes等使用Illumina测序方法,在Burkholderia ceuocepacia 中发现了13种未知ncRNA。并且发现尽管基因组相似度很高,来源不同的B.cenocepacia两菌株在调节反应上相差甚远,这或许可以解释他们栖息环境和致病潜力的差异。Passalacqua等同时使用Illumina和ABI SOLiD两种测序技术,研究炭疽芽抱杆菌不同生长阶段和芽抱形成过程中的转录改变,两种技术的结果表现出很好的相关性。通过该研究,对炭疽芽抱杆菌的全基因组转录起始位点和操作子结构进行了预测,发现许多以前未被注释的基因组区域也表现出显著的转录活性。在伤寒沙门氏菌的RNA-seq研究中,Perkins等发现了40个新的ncRNA 序列,根据RNA-seq的结果对基因组序列的注释信息进行了校正,并找到OmpR 操纵子的一些新成员。Cynthia等对幽门螺杆菌的转录组测序研究发现,操作子内部存在数百个与己知基因力一向相反的转录起始点,这说明其转录水平上存在的高度复杂性,并为其他物种的转录调控研究提供了新思路。
三、高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用
2005年以来,新一代DNA测序技术(Next-generation DNA sequencing)的发展,为微生物群落的分析带来了突破,群落中极度稀少的微生物如今也能被检出,并可以更精确地测定生境中各类微生物的相对丰度。新一代的测序技术(如焦磷酸测序技术,pyrosequencing)为微生物生态学提供了全新的技术手段,具有极为广阔的应用前景。
以往文献报道肠道菌群与人类代谢疾病之间存在着某种关联,为了研究糖尿病与肠道微生物的关系,Nadja Larsen等人以18个II型糖尿病男性患者及18个正常男性为研究对象,采用454高通量测序技术对其粪便中微生物16S rRNA基因的V4区进行了测序。序列分析结果发现这些序列分属于五个门的微生物,包括壁厚菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形杆菌门(phyla Proteobacteria),放线菌门(phyla Actinobacteria)和疣微菌门(phyla Verrumicrobia),其中壁厚菌门和拟杆菌门所占比例高达90%以上。糖尿病患者的肠道菌群中壁厚菌门和梭菌纲(Clostridia)的含量明显低于正常人。另外,拟杆菌门/壁厚菌门以及Bacteroidetes-Prevotella/C.coccoides-E.rectale的比例与血糖浓度成正相关,但是与身体指数却不相关。β变形杆菌(Betaproteobacteria)在糖尿病患者中也大量富集现象,并且这类细菌与血糖浓度也成正相关。以上结果揭示人类II型糖尿病的病因与肠道微生物群落组成变化有联系。
为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响,Filippo CD等人采用454高通量测序技术比较了15个健康欧洲孩子(EU)及14个健康非洲农村孩子(BF)肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色,而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个粪便样品的16S rRNA 基因V5-V6区DNA片段并进行高通量测序,共获得了438219条高质量的reads。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),壁厚菌门(Firmicutes)和变形杆菌门(Proteobacteria),然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部分,而壁厚菌所占比例较低。有趣的是,含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中,并且所占比例较高。