实验七 细胞染色体数目分析

实验七
细胞染色体分析
(秋水仙素裂解法)
一、原理
细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰
到好处，是研究染色体最好时期。
秋水仙素能破坏细胞纺锤体 , 并阻止其形成 , 使分裂的细胞停留在分裂中期。 秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。 低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散 空气干燥使细胞和染色体展平。
二、实验材料
1、有丝分裂抑制剂 100×浓缩的秋水仙素（20μg/ml）：将0.1mg
秋水仙素溶于5ml重蒸水中，分装后冰冻保存。
2、细胞消化液：0.25%胰蛋白酶溶液
3、低渗溶液：0.075mol/L KCl
4、固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1混合）
5、染液(Giemsa 吉姆萨染液)
Giemsa染色液原液：姬姆萨染料0.6g加于50mL甘
细胞重悬与浓度检测 每管加入200μl固定液，混匀。 吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上， 轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自 然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺 开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样
品。否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的
铺片效果。）
低渗处理，使细胞肿胀 将细胞沉淀用 1ml 37℃预温的 0.075mol/L 的 KCl 低渗溶液悬浮，混匀后置37℃温育20-35min。 固定
来自百度文库
加入新配制的固定液（甲醇∶冰乙酸） 1ml ，混 匀，1600r/min离心10min，弃上清液。
再加入固定液 1ml ，轻轻混匀，静置 20-30min ， 1600r/min离心10min，弃上清液。 再次加入固定液 1ml，轻轻混匀，静置20-30min或 4℃过夜，1600r/min离心10min，弃上清液。
油中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇 50mL，静置24h以上，过滤即成姬姆萨染色液原液， 装于棕色瓶内保存备用。 10% Giemsa染液：取原液1份加入9份 0.01mol/L pH7.2 PBS中混匀。
6、细胞：Marc-145细胞
7、载玻片：4℃预冷
三、操作方法
秋水仙素处理，使细胞停止分裂 取对数生长期的 Marc-145细胞一瓶，加入秋 水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml。 37℃温箱中继续培养2.5-3h。 收集处理的细胞 倾出秋水仙素处理液，用 0.25% 胰酶溶液消 化细胞，细胞消化好后加入DMEM培养液将细 胞吹下。 1600r/min离心10min收集细胞。
染色
用10% Giemsa染液染10-15min。流水冲洗，
自然干燥。
观察与计数 将载玻片置显微镜油镜下观察计数。
C
D
观察细胞的标准：
细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面 上。 染色体形态和分布良好。
最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认， 以免差错。 所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体 螺旋化程度或染色体长短大致一样。 在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染 色体存在，以免影响计数。