胚胎干细胞培养SOP

胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)

一、细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液

DMEM(高糖)

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST

ESGRO

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤

1．从液氮中取出一管细胞；

2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；

4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5．离心3分钟；

6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8．孵育。

冻存细胞

冻存液：90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：

1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

2．用细胞刮刀收集细胞；

3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；

4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm 的培养皿用6～7ml。）

5．分装于冻存管内，每管1ml；

6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被

准备500ml 0.1％明胶溶液

1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0. 5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了）；

2．置室温30分钟；

3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

1．去除培养液；

2．1×无钙镁PBS洗涤；

3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。

4．加入ES培养基使胰酶失活；

5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；

6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。

如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）

9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)

保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1

来计算传代比率。

三、体外分化

多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。

时间线（总时间为27～34天）第2步：4＋1天；第3步：4～10天；第4步：4天；第5步：10～15天

培养基

EB

配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液

DMEM(高糖)

胎牛血清

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST（P104U/mlS104μg/ml