质粒构建-protocol

一，引物设计:
1,选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

1，使用word
2，设计引物：primer-up
Primer-down
3，核对----送公司合成。

4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4℃保存。

二，PCR（P出目的片段）：
（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：
12ul韩家淮实验室的菌液，
相应的抗生素
94℃ 5min
菌液1ul 94℃ 30sec
2x PFU mix 25ul 58℃ 30sec
Primer 1ul 72℃ X min
2d H2O 23ul 72℃ 5min
（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）
3，跑胶、回收:
（1），配胶：
称0.6g的琼脂糖
加入60ml的1X TAE
加入0.6ul的EB(℃左右时)
25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）
4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温
箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。

可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。

三，酶切、链接：
1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）
insert ：上述胶回收产物
35ul
10 x H buffer（1.5x）7ul
50ul的体系 dd H2O 6ul
酶1 1ul
酶2 1ul
2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）
Vector （1ug/ul）：2 ul
10 x buffer（1.5x）3ul
20ul的体系dd H2O 13ul
酶1 1ul
酶2 1ul
为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。

4，连接：
2x Rapid Ligation 6ul
Vector 0.8ul
12ul的体系insert 4.5ul
（目的是为了多加点insert）T4 DNA Lignase 1ul
四，转化：
⑴、冰上20分钟-→热激：42℃、90秒-→冰上2分钟
⑵、加1ml SOC（或者1ml LB），37℃、180 rpm、45分钟。

⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。

再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。

⑷、250rpm、过夜。

五，质粒大抽：
六，收菌：
取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4℃。

再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。

（倒置于草纸上使液体流尽)。

七，重悬：
每管加入8ml的RES-EF(RnaseA)，重悬细菌沉淀—充分V ortex或用枪头吹打沉淀。

确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

3，裂解：
每管加入等量的L YS-EF bufffer，即8ml。

轻轻上下颠倒离心管4-6次，（勿震！！）室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。

注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA 污染
4，平衡：
⑴：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）
⑵：取15ml EQU-EF buffer 沿滤芯四周加入—充分平衡滤芯。

注意：①离心管内的液体不要浸没滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，②在过滤平衡液的同时，进行5、6步，防止滤芯干掉。

5，中和：
在等待EQU-EF buffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，颠倒混匀，冰上孵育5min。

（不能vortex）
6，离心、过滤：
⑴：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at 4℃--质粒存在于上清中。

（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）
⑵：将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。

7，洗一：
过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下来）--过滤完后，将滤芯弃掉。

8，洗二：
往滤柱中加入35ml的ENDO-EF buffer—去内毒素
9，洗三：
待滤完后再加入15ml的wash-EF buffer—过滤。

10，洗脱：
取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer.
(Elu-EF buffer预先放在50℃的恒温箱中加热，可提高洗脱效率)
11，沉淀：
待Elu-EF buffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分vortex），静止10min---10000rpm、30min、4℃---弃上清。

12，洗涤：
加5ml的70％酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm、10min、常温。

弃上清，重复上述步骤一次（再洗涤一次）弃上清---到超净台用200ul枪头把上清尽量洗净----再空离一次，在超净台用小枪头把液体洗净---吹干。

13，溶解：
取100-300ul高压过的H2O-EF溶解质粒--定量后，将质粒的浓度调至1ug/ul—最后，保存到-20℃。