姊妹染色单体区分染色法

姊妹染色单体区分染色法(Sister chromatid differentiation，SCD）是70年代中期发展起来的染色体处理技术。

Latt（1973）在培养的细胞中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），当用Hoechst33258 荧光染料染色时，发现了姊妹染色单体的色差反映和它们之间互换的现象。

1974年KO Renberg和Froeed-Lender改进了这一技术，建立了较简易的BrdU-Giemsa技术。

这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变，以及DNA的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题，还可以用于分析姊妹染色单体互换（Sister chromatid exchange, SCE）频率。

由于SCE能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量-效应关系。

因此，目前已把SCE列为检测致突变物、致癌物地常规指标之一。

一、原理
5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的复制过程中，掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。

根据DNA的半保留复制规律，哺乳动物或人的细胞在BrdU的培养液中经历了两个周期后，它的两条姊妹染色单体的DNA双链在化学组成上有了差别。

当染色体的DNA链的两条多核苷酸链都被BrdU所替换，Giemsa染色显示浅色，如果染色体的DNA链中仅有一条多核苷酸链被BrdU所替换，Giemsa染色显示深色。

应用姊妹染色单体区分染色法（SCD）研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姊妹染色单体互换。

二、用品和试剂
45℃水浴，紫外线灯（20W）。

余同外周血染色体制备。

试剂：BrdU溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下称取BrdU 2mg，然后在无菌室内加入无菌生理盐水4ml，用黑纸避光，4℃冰箱保存，新鲜配置。

1×SSC溶液：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 柠檬酸钠。

三、操作步骤
l．细胞培养：常规培养人外周血淋巴细胞，24h后，加入BrdU使其终浓度为20μg/ml。

2．继续避光培养48小时，终止培养前2—3小时加秋水仙碱。

3．培养结束收获细胞，常规制备染色体，操作同实验一。

4．染色体制片在37℃恒温箱内老化24小时或室温放置1—2天。

5．将染色体制片的玻片正面向上平铺在恒温（45℃）水浴锅上，在玻片上滴加已预热至45℃的1×SSC溶液。

6．将紫外灯放在恒温水浴上，灯与标本垂直，其外加盖报纸数张以阻挡紫外线。

照射距离为6cm，时间15min。

7．照射完毕后以蒸馏水洗去1×SSC。

8．1∶10 Giemsa染色5分钟。

9．自来水细流冲洗去多余染料，干燥，镜检。

10．计数SCE。

选择染色体分散较好，数目为46的中期分裂相20个进行观察计数，
在染色单体端部出现的互换计为一次SCE，
在染色单体中间出现的互换计为两次SCE。

凡在着丝粒部位发生一次互换，判断不是两条染色单体在着丝粒部发生的扭转，计为一次SCE，但另列入“着丝粒区互换（CME）”一项。

Sister Chromosome Exchange （SCE）
【实验目的】
熟悉制备SCE标本的原理和基本程序。

【实验原理】
姊妹染色单体交换（Sister chromatialexchange,SCE）是染色体同源座位上复制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重组，主要在DNA合成期形成，可能与DNA双链的断裂与复制有关，SCE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。

如果一个个体的SCE率明显增高，可表明染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。

在细胞分裂时，每条染色体均有两条染色单体组成，每条染色单体有一条双链DNA组成。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy- uridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。

当细胞生存环境中存在BrdU时，BrdU取代脱氧胸苷掺入到复制的DNA中。

经两个复制周期后，两条姊妹染色单体中一条DNA的双链均有BrdU掺入，而另一条DNA双链中仅有一条链有BrdU掺入。

利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有BrdU掺入的单体浅染，而只有一条链掺入BrdU 的单体深染。

当姊妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。

由于姐妹染色单体的DNA序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCE是由于染色体发生断裂和重接而产生的，因此，SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率，用来研究药物和环境因素的致畸效应。

【实验用品】
1. 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱、离心机、显微镜、采血器材、酒精灯、培养瓶、刻度离心管、胶塞、乳头吸管、试管架、载玻片、托盘天平、干燥烤箱、染色缸、电吹风、30W紫外灯。

2. 试剂：RPMI 1640培养液、小牛血清、秋水仙素（100μg/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200μg/mL）、低渗液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸。

【实验步骤】
1. 按半微量法采取外周静脉血，接种培养。

2. 37℃培养24小时后，加BrdU溶液（终浓度为8μg/mL）混匀。

3. 用黑纸包裹培养瓶，继续培养48小时。

4. 收获前加入秋水仙素（终浓度为0.2μg/mL），继续培养1小时。

5. 常规法制片。

将玻片标本室温放置2～3天。

6. 分化染色前一天，将标本置37℃过夜。

7. 在平皿中平行放置两根牙签，将玻片放在牙签上，加适量2×SSC溶液（以不超过标本为度）。

在标本上盖一张比玻片稍大的擦镜纸，使纸边浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液渗至玻片标本上，保持标本湿润。

8. 将平皿置55℃水浴面上，用30W紫外灯垂直照射标本30分钟，照射距离10cm。

9. 照射后轻轻取掉擦镜纸，立即用蒸馏水冲洗标本。

10. Giemsa染色5～10分钟；蒸馏水冲洗标本，气干。

11. 镜检，计数。

每个末端交换记为1次SCE，中部交换记为2次SCE。

【实验结果与分析】
观察30个细胞的分裂相，记录每个细胞的SCE总数，计算SCE频率。

中国人正常SCE频率为5.7±0.4。