黄曲霉毒素标准检测规程
食品中黄曲霉毒素M族的测定 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定1 范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素M1和M2（以下简称AFT M1和AFT M2）的测定方法。
本标准第一法为液相色谱-质谱联用法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第三法为试纸条法，适用于生鲜乳中AFT M1的测定。
第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的AFT M1和AFT M2用水和乙腈的混合溶液提取，上清液的浓缩液用磷酸盐缓冲液稀释后，经免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。
净化液经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
3 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.3 醋酸铵（CH3COONH4）。
3.1.4 氯化钠（NaCl）。
3.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
3.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.7 氯化钾（KCl）。
3.1.8 浓盐酸（HCl）。
3.1.9 氮气（N2）：纯度≥ 99.9 %。
3.1.10 石油醚（C2H2n+2）：沸程为30-60℃3.2 试剂配制3.2.1 5 mmol/L醋酸铵水溶液：称取0.39 g醋酸铵，溶于1000 mL水中。
3.2.2 乙腈-水溶液（25+75）：取250 mL乙腈加入750 mL水。
3.2.3 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。
3.2.4 磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠，1.20 g磷酸氢二钠（或2.92 g十二水磷酸氢二钠），0.20 g磷酸二氢钾，0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，再加水至1000 mL。
黄曲霉毒素测定
产品号:#8030测试前请仔细阅读本说明Veratox○R黄曲霉毒素定量测试盒在2—8℃冷藏—不要冻结黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一种剧毒且致癌的物质，它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株产生的。
黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1和G2。
黄曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。
最容易产生黄曲霉毒素污染的物质是谷物、花生、棉子、高梁和大多数的树果。
动物食入过量黄曲霉毒素的影响从慢性健康直到死亡，已经证明黄曲霉毒素能引起肝损坏或癌症、降低奶和蛋的产出、免疫抑制和干扰再生效率。
美国食品药物管理局已经规定了食品和饲料中最大黄曲霉毒素限量。
因此，准确测定黄曲霉毒素的含量，对于监测可能发生黄曲霉毒素污染的食品和饲料的质量来说，是非常重要的。
测试程序包括仔细的采样、化学提取、卫生学评价和定量分析。
预期范围本产品适用于如谷物、谷物粉、谷麦粉、谷物、大豆混合物、棉籽、棉籽粉、高梁、花生、爆花玉米、稻米、麦子、大豆粉和混合饲料等中黄曲霉毒素的定量检测。
预期用户本测试盒可供质量控制人员和其它需了解可能受到黄曲霉毒素污染的食物和饲料的人员使用。
由于技术很重要，所以操作者应接受Neogen代表培训，或由已接受过Neogen培训的人进行培训。
方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppb级的黄曲霉毒素。
样品和标准控制液中游离的黄曲霉毒素与轭合物中的黄曲霉毒素竞争抗体结合位臵。
清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明黄曲霉毒素越少。
将其臵于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中黄曲霉毒素的准确浓度。
贮存要求本试剂盒存放在2～8℃时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。
提供的材料1.48个包被了抗体的孔。
2.48个红色标记的混合孔。
3.4瓶1.5ml浓度为0、5、15、50ppb黄曲霉毒素控制标准液(黄色标签)（甲醇溶液的处理，见注意事项）。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
食品中黄曲霉毒素B1的测定
实验六食品中黄曲霉毒素B1的测定一、实验目的与要求学习薄层层析法测定粮食中黄曲霉毒素B1原理及步骤。
二、实验原理样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后,在波长365nm紫外光下产生荧光,根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。
三、实验仪器与试剂仪器:玻璃板:5×20cm;涂布器;色谱展开槽(25×6×4cm);紫外光灯: 100-125W,带有波长365nm滤光片;微量注射器:20uL,10uL各一支试剂:三氯甲烷(AR);正己烷(AR 沸程30-60)或石油醚(沸程60-90);甲醇(AR);苯(AR);乙腈(AR);无水乙醚(AR);丙酮(AR)。
(以上试剂应重蒸,并应经检验对薄层色谱测定无干扰)苯-乙腈(98:2)混合溶液;甲醇-水(55:45)混合溶液;三氟乙酸(AR);氯化钠(AR);无水硫酸钠(AR);硅胶G(薄层色谱用)。
5%次氯酸钠溶液:称取100g漂白精,加入500mL水,搅匀。
另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3.10H2O)溶于500mL温水中,倒入上述溶液中,搅匀,澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中,用作消毒剂。
黄曲霉毒素B1标准贮备液:用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFT B1标准品,先加入2mL乙腈溶解后,再用苯稀释至100mL,避光置于4℃冰箱中保存。
使用前用紫外分光光度计测定其浓度,再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。
(在350nm测定AFT B1的苯-乙腈溶液的吸光度,其摩尔消光系数为19800,可根据朗伯-比尔定律求出其浓度)。
黄曲霉毒素B1标准应用液I(1ug/mL):吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
黄曲霉毒素B1标准应用液II(0.2ug/mL):吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
黄曲霉毒素的测定(精)
取20.00mL甲醇水溶液臵于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静臵分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠
的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样 液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确 认试验 .
(5)稀释定量：
若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。 若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质 干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。 3.2.3 结果计算
(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边臵一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，臵于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化 钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。 其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其 在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT主要污染粮油及其制品，如花生、 花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严 重。Biblioteka 曲霉毒素允许量标准
食品品种 允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油 ≤20 玉米及花生制品 ≤20 大米、其他食用油 ≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品 不得检出
黄曲霉毒素检验方法
一、目的规范实验室检验方法。
二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
黄曲霉素的检测
黄曲霉毒素B1检测卡产地：湖南长沙简介:黄曲霉毒素（aflatoxins）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一组化学结构类似的真菌毒素。
目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。
黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。
前者为基本毒性结构，后者与致癌性有关。
M1、M2分别是由B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。
M1和M2 主要存在于牛奶中。
B1的毒性及致癌性最强，在天然污染的食品中以B1最为多见。
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。
它被证明对人和动物的肝脏、肾脏等组织和器官具有很大的危害。
产生黄曲霉毒素的霉菌（如黄曲霉、寄生曲霉等）遍及世界各地，黄曲霉毒素的污染可以发生在植物的生长、收获和加工、贮藏、运输等过程中。
及时发现污染源是最好的预防黄曲霉毒素污染的方法。
检测原理黄曲霉毒素快速检测卡是应用免疫竞争法分析原理，结合胶体金标记技术和免疫层析技术设计的一种快速检测卡。
具有简单、快速，无需特殊的仪器设备，既可以在实验室进行，也可在农场、饲料混合车间等实地进行测定。
结果准确，灵敏度度为5ppb，准确率大于95%。
适用于粮食、饲料原料、配合饲料、发酵产品、加工食品、中药原料和中成药等样本中的黄曲霉毒素的检测。
试剂盒组成：40次/盒。
1、检测卡：40人份。
2、样品抽提液：40瓶×2ml。
3、样品稀释液：40瓶×0.8ml。
4、说明书：1份。
操作步骤1、检测试卡袋中取出所需的试卡，在夹上做好标准。
向样品槽中缓慢加入100微升处理后的样品。
2、静置10分钟后，观察测定结果。
20分钟后的结果无效。
结果A、阴性B、阳性C、无效A：阴性：对照线(C)和测试线(T)同时出现，表明样品中黄曲霉毒素的浓度小于5ng/ml。
黄曲霉毒素AFB1检测操作规程
黄曲霉毒素AFB1检测操作规程1 原理AgraQuant® 黄曲霉毒素检测试剂盒应用固相直接竞争酶联免疫吸附原理，用70%甲醇从研磨样品中提取黄曲霉毒素。
样品提取液或黄曲霉毒素标准品与酶-黄曲霉毒素偶合物混匀后加入到抗体包被的微孔中，样品中的黄曲霉毒素或黄曲霉毒素标准品与酶-黄曲霉毒素偶合物中的黄曲霉毒素竞争结合微孔中的特异抗体。
经过洗板去除未参加抗原-抗体反应的的黄曲霉毒素，当酶的底物被加入到微孔中，颜色变为蓝色，且颜色深浅与样品中或标准品中黄曲霉毒素含量成反比。
加入反应终止液终止反应后，反应液颜色应由蓝色转为黄色。
在450nm(OD450)滤镜及630nm示差滤镜下使用酶标仪对微孔板进行吸光度值测量。
利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品的吸光度值与标准品的吸光度值进行比较以进行结果的判读。
2 试剂与仪器2.1 单道移液枪（量程：0~200μL、0~1000μL）2.2 八道移液枪（量程：0~300μL）2.3 定时器2.4 吸水纸2.5 试剂槽3个2.6 仪器：酶标仪3 操作步骤3.1样品的准备/萃取3.1.1获取具有代表性的样品，使用研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。
3.1.2称取20g 研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。
3.1.3加入100mL 70/30（v/v）甲醇/水萃取溶液并密封广口瓶。
注意：样品与萃取溶液比例应为1:5（w:v）。
3.1.4摇床上振荡混合10分钟。
3.1.5静置样品，用双层滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液（滤液必须澄清）。
3.1.6用提供的分析缓冲液对滤液进行1:2稀释。
例如：将100µL待检滤液加入100µL分析缓冲液中，混匀准备进行随后实验。
3.2 检测步骤3.2.1将绿色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品（0, 2, 5, 20 & 50ppb）或样品能够对应一个稀释孔。
黄曲霉素的检测
黄曲霉素的检测黄曲霉素的检测000部分国家检验检疫要求● 1995年,世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15ug/kg.●我国政府对各种食物中黄曲霉毒素的最高允许量见表2.表2 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量食物名称最高允许含量/(ug/kg)玉米,花生,花生油,坚果和干果(核桃,杏仁)玉米,花生仁制品(按原料折算)大米,其他食用油(香油,菜籽油,大豆油,葵花油,胡麻油,茶油,麻油,玉米胚芽油,米糠油,棉籽油)其他粮食(麦类,面粉,薯干),发酵食品(酱油,食用醋,豆豉,腐乳制品),淀粉类制品(糕点,饼干,面包,裱花蛋糕)牛乳及其制品(消毒牛奶,新鲜生牛乳,全脂牛奶粉,淡炼乳,甜炼乳,奶油),黄油,新鲜猪组织(肝,肾,血,瘦肉)20(黄曲霉毒素b1)20(黄曲霉毒素b1)10(黄曲霉毒素b1)5黄曲霉毒素b1)0.5(黄曲霉毒素m1)●美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指b1+b2+g1+g2的总量)不能超过15ug/kg.人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ug/kg,其他动物饲料中的含量不能300ug/kg.●而欧盟国家规定更加严格,要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素b1的含量不能超过0.05ug/kg.检验检疫方法薄层层析法薄层层析(thin-layer chromatography,tlc)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年,它被列为aoac (association of official agricultural chemists)标准方法,该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.液相色谱法液相色谱(liquid chromatography,lc)与薄层层析在许多方面具有相似性,二者互相补充.通常用tlc进行前期的条件设定,选择适宜的分离条件后,再用lc进行黄曲霉毒素的定量测定.免疫化学分析方法利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法(radioimmunoassay,ria),酶联免疫法(enzyme-linked of immunosorbent assay,elisa)和免疫层析法(immunoaflinity columnassay,ica).它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定.(1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-hplc法免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果,但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素b1)含量,而且易出现假阳性结果,难以控制.免疫亲和柱法(包括荧光光度法和hplc法)却能达到既定量准确又快速简便的要求.免疫亲和柱的使用可以避免传统tlc和hplc的缺点,同时免疫亲和柱与tlc和hplc法结合可以大大提高工作效率,提高灵敏度和准确度.黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段,用荧光计,紫外灯作为检测工具的快速分析方法.它克服了tlc和hplc法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒,异味的有机溶剂,毒害操作人员和污染环境的缺点.同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快,一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间;仪器设备轻便容易携带,自动化程度高 ,操作简单,直接读出测试结果,可以在小型实验或现场使用.可以进行黄曲霉毒素总量 (b1b2g1g2) 的测定,检测限可达到1ug/kg,达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg.黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的hplc法更加安全,可靠,灵敏度和准确度高.它采用单克隆抗体免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高.分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤,稀释后,用免疫亲和柱净化,以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度,然后用荧光分光光度计进行定量.也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入hplc中,对黄曲霉毒素b1,b2,g1,b2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg.(2) 酶联免疫吸附法:1996年,nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便,敏感,特异,可作为多种抗原或抗体的测定,20世纪70年代后期,该方法引入真菌毒素的检测中,下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素b1.原理:将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量.(3) 微柱筛选法可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素b1,b2,g1,g2的总量.原理样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后,在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环,其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光,则样品为阴性(方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素b1,b2,g1,g2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量.(4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5-10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选.检测方法分析薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法,由于其检测周期长,程序复杂,所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求.随着现代科学技术的不断发展,特别是免疫学,生物化学,分子生物学的不断发展,人们已创建了不少快速,简便,特异,敏感,低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法.而且以金标试纸为代表的这些方法已经被先进国家所广泛使用,引进和消化这些先进的方法是我们检测领域的当务之急.免疫亲和柱法优点很多,但由于检测费用过高,而无法普及.而一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法似乎更适用于我国,值得推广.。
黄曲霉毒素的危害限量标准及快速定量检测方法
黄曲霉毒素的危害、限量标准及快速定量检测方法黄曲霉毒素（Aflatoxins，简写 AF）主要为黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物。
在温暖与潮湿的气候地区粮食和饲料凡是被黄曲霉和寄生曲霉污染的都可能存在黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素最易污染的有花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆粕被黄曲霉毒素污染的程度轻些。
在我国，粮食和饲料被黄曲毒素污染的概率很高， 给饲料企业以及养殖业主带来了很大的损失，人们食用含有黄曲霉毒素的食物危害到人体健康。
一、黄曲霉毒素的理化特性目前已经确定的黄曲霉毒素的结构有AFB1、AFB2、AFM1等 18 种， 它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮（又名香豆素）， 前者为其具有毒性的结构，后者可能与其的致癌性有关。
黄曲霉毒素很难溶解于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿以及二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂中。
分子量为 312-346，熔点为 200-300℃，黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理方式对其的破坏很小， 只有在熔点的温度下才能发生分解。
黄曲霉毒素遇碱情况下能迅速分解， 但此应可逆， 即在酸性的条件下又能复原。
一般来说，温度30℃、相对湿度80%、谷物水份在14%以上（花生的水份在9%以上）最适合黄曲霉繁殖和生长。
在 24-34℃之间， 黄曲霉菌产毒量最高。
几乎所有谷物、饲草和各种食品（包括畜产品）都可作为黄曲霉基质。
二、黄曲霉毒素对动物和人的危害2.1 黄曲霉毒素对动物的危害黄曲霉毒素的毒性非常高，是目前已发现霉菌中毒性最大的一种。
目前发现的18种黄曲霉菌毒素家族中， AFB1的毒性最为最为强烈，AFM1、AFG1 次之，AFB2、AFG2、AFM2 毒性较弱。
AFB1的毒性是砒霜的68倍，其诱发肝癌的能力甚至比二甲基亚硝胺大75倍之多。
其毒性的大小因动物的种类、年龄、性别、体况及营养状况的不同而有所差异，年幼动物、雄性动物较敏感。
黄曲霉毒素标准检测规程.
AFB10.08 0.2 0.6 1.97
AFB20.04 0.12 0.2 0.63 4、职责
部门名称部门职责
质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督Leabharlann 行。5、程序5.1原理
测定的基础是抗原、抗体反应,抗体连接在柱体内,样品中的黄曲霉毒素B1经过提取、过滤、稀释,然后缓慢的通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱,在免疫亲和柱内毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素B1,然后注入到分析仪器中用于检测。
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数:1
5.3.3适用于中药(2015版药典规定的19味中药等
----15g±0.01g样品(固体样品需粉碎,并过2mm分样筛加入75mL 80%乙腈-水溶液混匀;
----高速均质(≥10,000r/min1min,或摇床(200r/min~300r/min剧烈振荡20min,用快速定性滤纸过滤,收集滤液;
变更类型:A –新起草M -修订
----高速均质(≥10,000r/min1min,或摇床(200r/min~300r/min剧烈振荡20min,用快速定性滤纸过滤,收集滤液;
----取10mL滤液加入20mL蒸馏水稀释,再用微纤维滤纸过滤,并收集滤液作为上样液;
----取15mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数:1
5.3.2适用于辣椒、花椒、黄豆酱等调料,面粉、麦芯粉、芝麻油及其它植物油、谷草
5.2溶液配制
5.2.1 70%甲醇-水溶液:取700mL甲醇,加入300ml去离子水混匀即可。
5.2.2 80%乙腈-水溶液:取800m乙腈,加入200ml去离子混匀即可。
黄曲霉毒素检测标准方法汇总
流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。
另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。
此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。
若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。
所得溶液的浓度约为50g/L。
污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。
黄曲霉毒素测定标准操作规程
1. 目的：建立黄曲霉毒素测定标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：2.1. 《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用黄曲霉毒素测定法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.内容：5.1. 本法系用高效液相色谱法（附录ⅥD）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
5.1.1. 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40：18：42）为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长γex=360nm（或365nm），发射波长γem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
5.1.2. 混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
5.1.3. 供试品溶液的制备：取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标【原创实用版3篇】目录（篇1）1.黄曲霉毒素的危害性2.黄曲霉毒素的检测方法2.1 薄层分析法2.2 酶联免疫法2.3 液相色谱法2.4 生物鉴定法2.5 试剂盒法正文（篇1）黄曲霉毒素是一种致癌物质，长期接触可使人的抵抗力下降，急性中毒可引起恶心、呕吐，发烧、黄疸等肝炎症状，长期接触可引起致癌、致畸。
致癌的话主要导致消化道肿瘤，比如食道癌、胆管癌。
因此，对黄曲霉毒素的检测显得尤为重要。
目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有以下几种：1.薄层分析法：此方法操作简单、费用低廉，是国内外用的最多的一种测量方法。
2.酶联免疫法：这是近年来研发出了一种新颖的测量方法。
3.液相色谱法：可准确分离黄曲霉素的各种毒素，检测准确度高。
4.生物鉴定法：其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，共有 10 种。
5.试剂盒法：现在检测粮食，饲料里面霉菌毒素主要就是试剂盒（ELISA) 法。
目录（篇2）1.黄曲霉毒素的危害性2.黄曲霉毒素的检测方法2.1 薄层分析法2.2 酶联免疫法2.3 液相色谱法2.4 生物鉴定法2.5 试剂盒法正文（篇2）黄曲霉毒素是一种致癌物质，长期接触可以使人的抵抗力下降，急性中毒可引起恶心、呕吐，发烧、黄疸等肝炎症状，长期接触可引起致癌、致畸。
致癌的话主要导致消化道肿瘤，比如食道癌、胆管癌。
因此，对黄曲霉毒素的检测显得尤为重要。
目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有以下几种：1.薄层分析法：此方法操作简单、费用低廉，是国内外用的最多的一种测量方法。
2.酶联免疫法：这是近年来研发出了一种新颖的测量方法。
3.液相色谱法：可准确分离黄曲霉素的各种毒素，检测准确度高。
4.生物鉴定法：其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，共有 10 种。
5.试剂盒法：这是目前检测粮食，饲料里面霉菌毒素主要采用的方法。
目录（篇3）1.黄曲霉毒素的危害性2.黄曲霉毒素的检测方法2.1 薄层分析法2.2 酶联免疫法2.3 液相色谱法2.4 生物鉴定法2.5 试剂盒法3.检测黄曲霉毒素的重要性正文（篇3）黄曲霉毒素是一种致癌物质，长期接触可以使人的抵抗力下降，急性中毒可引起恶心、呕吐，发烧、黄疸等肝炎症状，长期接触可引起致癌、致畸。
黄 曲 霉 毒 素 检 验 方法
一、目的规范实验室检验方法。
二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。
黄曲霉毒素B1检测的操作规程
1 适用范围本方法适用于测定全价饲料及脂肪含量小的固体原料（如玉米、玉米副产物等）。
2 操作方法1 样品处理：称取5.0g粉碎后的样品于具塞三角瓶中，准确加入25.0毫升甲醇水（1+1）溶液，（现配现用）。
振摇15分钟过滤，收集试样滤液，此液为样品提取液。
根据样品的国家标准允许量标准，用A试剂（样品稀释液）将样品提取液进行适当稀释，玉米一般将提取液稀释10倍（取滤液50uL+450uLA试剂），全价料滤液一般稀释4倍（取滤液50uL+150uLA试剂）稀释后放在混匀器上混匀，即为待测样液。
2、试剂的配制：每瓶C试剂准确加入1.5毫升D试剂（用移液枪移两个750uL）。
配成实验用酶标抗原溶液；取一瓶E试剂（浓缩洗涤液）加入300毫升蒸馏水中，配成洗涤液待用，均在2—8℃保存。
3、试剂平衡：将测试盒于室温中放置15分钟以上，平衡至室温。
4、小孔编号：根据实验需要截取相当孔数放置反应板框架上，设定一号孔为仪器调零孔（空白孔），2号孔为阴性对照孔，3号孔为阳性对照孔，其余孔为样品孔。
5、洗板（激活抗原）：每孔加入250uL洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干（注意：不能在同一张纸上重复多次拍打），重复洗板一次，放置、甩掉、拍干。
6、加样：第1步：第一个孔加50uLA稀释剂，第二个加50uLB试剂（0.1AFB1标准溶液），第三个孔加50 uLB试剂（1 AFB1标准溶液），其余孔加入相应待测样液。
第2步：1号孔加入50uLD试剂，从第2个孔开始加50uLC试剂，加完轻轻摇下，在37℃培养箱中培养半个小时，最好用书包着避光。
半个小时后，洗板，甩掉反应液，拍干。
每孔加入250洗涤液后，放置两分钟，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，再重复洗涤4次。
第3步：显色：每孔分别加入50uL F试剂（显色液）和50uL G试剂（显色液），摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15分钟（可以F和G混合加100uL，现用现配）。
黄曲霉毒素测定
同单向展开法。
3.2.4 说明及注意事项
用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25g ／L)，浸泡消毒后再清洗之。
20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来， 对层析的结果产生一定影响。 • 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 • 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 • 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。
黄曲霉毒素B1标准溶液
展开与观察
•
在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。
再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开
10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：
•
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标
准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上
第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中AFTB1
• 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物 质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格 规定。
• AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染 严重。
黄曲霉毒素允许量标准
• 食品品种 允许量标准（ppb或10-6）
• 玉米、花生、花生油 ≤20
次氯酸钠溶液
• 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均 匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于 500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。 此液含次氯酸25g／L。
• 思考题： • 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ • 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可
食品中黄曲霉毒素M族的测定 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定1 范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素M1和M2（以下简称AFT M1和AFT M2）的测定方法。
本标准第一法为液相色谱-质谱联用法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法，适用于乳、乳制品和特殊膳食用食品中AFT M1和AFT M2的测定。
本标准第三法为试纸条法，适用于生鲜乳中AFT M1的测定。
第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的AFT M1和AFT M2用水和乙腈的混合溶液提取，上清液的浓缩液用磷酸盐缓冲液稀释后，经免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。
净化液经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
3 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.3 醋酸铵（CH3COONH4）。
3.1.4 氯化钠（NaCl）。
3.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
3.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.7 氯化钾（KCl）。
3.1.8 浓盐酸（HCl）。
3.1.9 氮气（N2）：纯度≥ 99.9 %。
3.1.10 石油醚（C2H2n+2）：沸程为30-60℃3.2 试剂配制3.2.1 5 mmol/L醋酸铵水溶液：称取0.39 g醋酸铵，溶于1000 mL水中。
3.2.2 乙腈-水溶液（25+75）：取250 mL乙腈加入750 mL水。
3.2.3 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。
3.2.4 磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠，1.20 g磷酸氢二钠（或2.92 g十二水磷酸氢二钠），0.20 g磷酸二氢钾，0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，再加水至1000 mL。
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黄曲霉毒素标准操作规程
1、目的
为了规范亲和柱净化样本中黄曲霉毒素的操作流程，特制订本操作规程。
2、范围
本标准适用于粮食、饲料、中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测。
3、检出限和定量限
项目
岛津安捷伦
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
AFG10.12 0.4 0.9 3.0
AFG20.08 0.2 0.3 0.86
AFB10.08 0.2 0.6 1.97
AFB20.04 0.12 0.2 0.63 4、职责
部门名称部门职责
质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序
5.1 原理
测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素B1经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用甲醇洗脱黄曲霉毒素B1，然后注入到分析仪器中用于检测。
5.2 溶液配制
5.2.1 70%甲醇-水溶液：取700mL甲醇，加入300ml去离子水混匀即可。
5.2.2 80%乙腈-水溶液：取800m乙腈，加入200ml去离子混匀即可。
5.2.3 1% 吐温-水溶液：取1ml 吐温-20，加入去离子水并定容至100ml。
5.2.4 黄曲霉毒素混合标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到50 ng/ml、
20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml。
5.3 样品前处理
5.3 1 适用于玉米、小麦等粮食作物，花生及其制品，坚果、玉米油、花生油、饲料等
样品
----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛），加入5g 氯化钠与125mL 70% 甲醇-水溶液混匀；
----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL 滤液加入20mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取15mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
5.3.2 适用于辣椒、花椒、黄豆酱等调料，面粉、麦芯粉、芝麻油及其它植物油、谷草
等样品
----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入125mL 80%乙腈-水溶液混匀；
----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL 滤液加入40mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
5.3.3 适用于中药（2015 版药典规定的19 味中药等）
----15g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入75mL 80%乙腈-水溶液混匀；
----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL 滤液加入40mL 1% 吐温-水溶液，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
5.3.4 适用茶叶样品：
----10g±0.01g 加入2g 氯化钠，加入纯甲醇溶液100mL，混匀；
----高速均质（≥10,000r/min）均质1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL 滤液加入40mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：2
5.4 净化
----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上；(3mL 的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)
----将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；
----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；
----待液体排干后，用10mL去离子水洗涤2次，流速2～3滴/秒；对于颜色附着比较深的样品，先用1% Tween-20 水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL 流速2～3滴/秒；
----待液体排干后，上样1mL 甲醇，流速1 滴/秒，收集洗脱液并定容至1mL；
----洗脱液用0.22μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。
* 每次上样前都要将上次液体完全排干。
5.5 液相测定
5.5.1 液相色谱条件
C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；
流动相：55%甲醇（AFB1）；53%甲醇（AFT）
流速：0.8mL/min；
柱温：40℃；
进样体积：20µL
荧光检测器：激发波长：360nm；
发射波长：440nm；
5.5.2 色谱定量
分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的峰面积带入标准曲线，得到试样中黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2的浓度，标准品色谱图参考下图：
数据文件名:AFT-B1-10ppb.lcd
样品名:AFT-B1-10ppb
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5min
0510152025mV
检测器A Ex:360nm,Em:440nm A F G 2
A F G 1
A F
B 2
A F
B 1
5.6 注意事项
----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。
----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。
----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。
----柱容量：300ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降
低上样液的体积，重新检测。
----pH ：亲和柱的上样溶液pH 需在6～8 之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调
节pH 。
----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。
----黄曲霉毒素B 1 可致癌，应戴手套操作。
----使用过的容器及黄曲霉毒素B 1 溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V ）浸泡过夜。
6、
相关文件
《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、
相关记录 N/A
8、附件
N/A
9、修改历史记录
编号变更类型修改条款及主要内容修改人修改日期
01 A N/A 魏丹丹2016.2.24
变更类型：A –新起草M - 修订。