染色体加倍

实验13 低温诱导染色体加倍
石门中学人教版新教材中高中生物实验创新性使用研究课题组
一、实验目的：1．学习低温诱导植物染色体数目变化的方法
2．理解低温诱导植物细胞染色体数目变化的作用机制
二、实验原理：
思考题1、进行正常有丝分裂的植物分生组织细胞，在有丝分裂后期，染色体的着丝点分裂，子染色体在的作用下分别移向两极，最终被到两个子细胞中去。

思考题2、用低温处理植物组织细胞，使受到抑制，以致影响染色体被拉向两极，细胞也不能分裂成两个子细胞，于是，植物细胞染色体数目发生变化。

思考题3、除低温外，你还知什么因子会引起染色体数量变化？
三、方法步骤：
1、低温诱导：培养洋葱根。

待洋葱根长出1cm左右时，将整个装置放入冰箱的低温室内（40C）。

诱导培
养36h。

2、固定形态：
思考题4、剪取诱导处理的根尖约0.5-1cm，放入中浸泡0.5-1h，以固定细胞的形态，然后用体积分数为95%的酒精冲冼2次
3、制作装片：
思考题5、制作装片需要哪些环节？
思考题6、体积分数为15%的盐酸溶液，改良苯酚品红染液在这个实验中分别起什么作用？
上述填空题参考答案：
实验流程：洋葱大葱大蒜4℃36h 0.5-1 卡诺氏固定液95%的酒精75%酒精观察植物细胞有丝分裂解离漂洗染色制片正常二倍体染色体数目发生改变
注意事项：25 温度
思考题7、体积分数为95%的酒精溶液在这个实验中起什么作用？
4、观察：用显微镜观察，并寻找发生了染色体数目变化的细胞。

思考题8、先用低倍镜观察的目的是什么？
思考题9、有人认为通过上述实验可以得出“低温能诱导植物细胞染色体数目发生变化”这一结论，你同意吗？为什么？
思考题10、秋水仙素与低温都能诱导染色体数目加倍，这两种方法在原理上有什么相似之处？
四、课堂练习：
1．下列有关“低温诱导植物染色体数目的变化”实验的叙述，正确的是
A．低温诱导能抑制分裂时纺锤体的形成B．改良苯酚品红液的作用是固定和染色
C．固定和解离后的漂洗液都是95%酒精D．该实验的目的是了解纺锤体的结构
2．用浓度为2％的秋水仙素，处理植物分生组织5～6小时，能够诱导细胞内染色体加倍。

那么，用一定时间的低温(如4 ℃)处理水培的洋葱根尖时，是否也能诱导细胞内染色体加倍呢?请对这个问题进行实验探究。

(1)针对以上问题，你作出的假设是：。

你提出此假设的依据是。

(2)低温处理植物材料时，通常需要较长时间才能产生低温效应，根据这个提示将你设计的实验组合以表格形式列出来。

(3)按照你的设计思路，以作为鉴别低温是否诱导细胞内染色体加倍的依据。

为此，你要进行的具体操作是：
第一步：剪取根尖2～3mm。

第二步：按照→ → →
步骤制作。

3．现有甲乙两种可能有一定毒性的化学物质，实验室研究人员欲通过动物细胞培养的方法来鉴定它们是否有毒性并比较二者毒性的强弱。

请你以一个研究人员的身份参与此项研究，完成下列实验报告并回答有关问题。

Ⅰ．实验原理：。

根据这种变异细胞占全部培养细胞的百分数（以下称Q值），可判断该化学物质的毒性。

Ⅱ．实验材料：活的小白鼠胚胎。

Ⅲ．药品用具：胰蛋白酶液、动物细胞培养液、动物细胞固定液、适宜浓度的龙胆紫溶液、滴管、培养皿、剪刀、锥形瓶、培养瓶、恒温箱、载玻片、盖玻片、显微镜、小白鼠正常体细胞有丝分裂各时期高倍显微照片。

Ⅳ．实验步骤：
（1）制备细胞悬浮液：把活的小白鼠胚胎放在培养皿中剪碎，转入锥形瓶中，加入胰蛋白酶液处理，使胚胎组织离散成单个细胞，再加入动物细胞培养液，制成细胞悬浮液。

（2）进行细胞培养：
①取A、B、C三个洁净的培养瓶，。

②向A培养瓶中加入化学物质甲，向B培养瓶中加入等量的化学物质乙，并将培养瓶摇匀。

③。

（3）制作临时装片：
①当细胞增殖到大约第8代左右时，同时从恒温箱中取出三个培养瓶，用胰蛋白酶液处理，使培养的细胞
从瓶壁上脱落，再加入动物细胞固定液以迅速杀死细胞并固定细胞分裂相。

②静置一段时间后，分别从各培养瓶底部吸取适量的细胞悬浮液，滴在与培养瓶有相同编号的载玻片的中
央，，3~5 min后，盖上盖玻片。

（4）镜检和统计：
把临时装片放在显微镜下，先用低倍镜后用高倍镜，寻找处于期的细胞，并与对比以确认发生变异的细胞，同时统计该期变异的细胞占该期细胞总数的百分数（Q值）。

Ⅴ．结果与结论：
经研究人员实验得知，A、B、C三个培养瓶的Q值依次为：QA=1．3%、QB=12．5%、QC=0．1%，由此可知该实验的结论是
Ⅵ．回答问题：
在实验中，C培养瓶起什么作用与小白鼠正常体细胞有丝分裂各时期高倍显微照片有何不同？。

低温诱导染色体加倍参考答案
思考题：
思考题1：纺缍丝、平均分配思考题2：纺缍体的形成
思考题3：秋水仙素思考题4：卡诺氏液（注：它由无水乙醇3份，冰醋酸1份或无水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸1份配制而成）
思考题5：解离→漂洗→染色→制片思考题6：解离；染色；
思考题7：冲洗卡诺氏液；与盐酸溶液一起参与解离。

思考题8：寻找染色体形态较好的分裂相，确认某个细胞发生染色体数量变化。

思考题9：不同意；应还要设置对照组（正常气温处理），否则不严密。

思考题10：两者都是通过抑制分裂细胞内纺锤体的形成，使染色体不能移向细胞两极，而引起细胞内染色体数目加倍。

课堂练习：1、A；
2、(1)用一定时间的低温处理水培的洋葱根尖能够诱导细胞内染色体加倍。

依据是低温能够影响酶的活性(或
纺锤丝的形成、着丝点的分裂)，使细胞不能正常进行有丝分裂。

(学生也以提出其它假设，只要能够运用所学的生物知识进行合理的解释，也可得分。

)
(2)只要学生设计的表格达到以下两个要求，均给分：A．至少作两个温度的对照(常温和时间)；B．间
隔相等的培养时间进行取样。

以下表格仅作参考。

在显微镜下观察和比较经过不同处理后根尖细胞内染色体数目(或染色体计数) 解离漂洗染色制片细胞有丝分裂装片。

3、Ⅰ．有毒物质加入细胞培养液后，培养的动物细胞会发生染色体结构和数目的变异（答“染色体变异”亦可）
Ⅳ．
（2）①分别加入等量的细胞悬浮液（无“等量”扣分）
③把三个培养瓶放在37 ℃（或适宜温度）的恒温箱中培养（无“37 ℃”又无“适宜温度”扣分）（3）②加1—2滴适宜浓度的龙胆紫溶液染色（无“染色”不扣分）
（4）有丝分裂中（无“中”无分）；小白鼠正常体细胞有丝分裂各时期高倍显微照片Ⅴ．甲乙两种化学物质均有毒性，且乙的毒性比甲的毒性大
Ⅵ．C瓶作为A、B两瓶的对照组，起对照作用
对人教版低温诱导植物染色体数目变化实
验的改进
延庆一中王利艳
内容摘要：在人教版必修二《遗传与进化》模块中，变异来源染色体畸变后安排了一个实验《低温诱导植物染色体数目变化》的实验，教材中写到将洋葱4℃低温处理36h即可观察到染色体数目发生改变的细胞，但经过实践按照教材所示的方法很难观察到染色体加倍的现象。

在理论上用低温处理分生组织细胞，能够抑制纺锤体的形成，以致影响染色体被拉向两极，细胞也不能分裂成两个字细胞，于是植物细胞染色体数目发生变化。

在中国的帕米尔高原已发现有大量的天然多倍体植物存在,但在实验室低温诱导方面还是少有报道,因为条件不太好摸，也不稳定,重复性不好,出现率也不高。

因此设计了一组不同低温和处理时间的实验，对低温诱导能否使植物形成多倍体进行探究，旨在为人教版低温诱导植物染色体数目变化实验提供改进措施。

主题词：人教版低温诱导多倍体改进
正文：对人教版低温诱导植物染色体数目变化实验的改进
引言：多倍体植物具有很多优点，比如三倍体植物的不孕性，可降低植物生殖生长所需能量从而提高产量；还有多倍体植物基因剂量效应，使得多倍体植物具有较大的营养器官和生殖器官，也可提高产量等等。

因此如何获得多倍体植物已成为农业技术中的焦点，同时也是难点。

诱发多倍体的方法主要有物理法和化学法两种。

物理的方法包括各种射线、异常温度、高速离心力、高温处理等。

化学法是用秋水仙素、对二氯苯等化学药剂处理等。

被广泛应用的主要是秋水仙素，成功率最高，经秋水仙素处理后，正处于有丝分裂的植物细胞，其纺锤体的产生受到抑制，这样染色体虽然进行了分裂，但细胞并未分开，因此，细胞内的染色体数成倍增加。

此后，细胞再进行分裂就形成了多倍体。

虽然秋水仙素被广泛使用，但如果应用于中学教学，秋水仙素属于有毒物品购买需向公安局备案，除此之外成本也较高，这个时候就必须选择其他的方法来诱导多倍体了，低温是个不错的选择。

低温是物理因素，也能使微管解聚，即与秋水仙素有同样的作用。

在动物（较低等）的多倍体诱导上已取得广泛成功，鲍鱼卵受精在3℃水温下可获三倍体；诱导率为70%。

扇贝为78%，牡蛎低温诱导率是72%。

虽然已在中国的帕米尔高原发现有大量的天然多倍体植物存在，但在植物的多倍体人工诱导方面则鲜有报道。

故设计本实验对低温诱导能否使植物形成多倍体进行探究，旨在为低温诱导植物多倍体育种可行性提供科学依据。

一. 材料与方法
1实验材料
1.1实验材料：大蒜（Allium sativum）（2n=16)，购于北京市延庆县恒生市场市场。

人教版教材中选用的是洋葱，洋葱和大蒜都属于百合科葱属，并且大蒜个体小、出根多、好培养，因此选择大蒜替代洋葱。

1.2实验试剂：0.1%秋水仙素、卡诺氏固定液（无水乙醇3份、冰乙酸1份混合即可）、解离液（95%乙醇3份、浓盐酸1份混合即可）改良品红。

2实验方法
本实验设置两个对照组：
对照组一：用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长后再在室温下连续培养72h，然后再放入4摄氏度的培养箱中24h作取材前处理。

对照组二：用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长时转入0。

1%秋水仙素溶液中培养36h取出，再转入清水中继续培养48h，然后用0.1%秋水仙素溶液处理3h作取材前处理。

2.2多倍体诱导
用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长时，分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养48h取材染色镜检。

用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长时，分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养72h，取出在室温下培养24h，然后再分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养24h，然后取材进行染色镜检。

2.3生物学形态观察
观察根尖形态是否发生变化，若发生变化及时记录变化情况。

2.4染色体鉴定
2.4.1取材：剪取处理好的的根尖，长约5mm，3-5条(重复)。

放入小瓶中用清水冲洗2~3遍。

2.4.2固定：加入卡诺氏固定液于瓶中，加盖。

固定时间以2h为宜。

固定液应为材料的15倍体积以上。

2.4.3解离：吸出固定液，加入解离液。

在25℃下处理30分钟，然后吸去解离液，清水洗3次，洗去酸性解离液有利于下一步的染色。

2.4.4染色：以浸染一下为好，加少许染液于瓶中，染15分钟以上。

用镊子取根尖于玻片中央，滴半滴染液，盖上盖玻片。

用带橡皮头的铅笔轻轻压敲，使根尖细胞分散成雾状。

用吸水纸吸去多余染色液，以保洁净。

在酒精灯火焰上过2-3次，以便分色。

2.4.5镜检：经镜检挑选染色体分散良好分色清晰的细胞拍照留证。

二. 结果与分析
1 染色体鉴定结果
图三：0℃处理96h
(2n=2x=16)
图四：8℃处理96h
(2n=2x=16)
图六：对照二秋水仙素36h
(2n>32)
图五：对照一清水
(2n=2x=16)
图七：2℃处48h 图八：2℃处理96h
(2n=2x=16) (2n=2x=32)
图十：4℃处理96h (2n=2x=32)
图九：4℃处理48h (2n=2x=16)
从以上各图可看出，经过0℃、8℃处理96h的诱导株细胞和室温处理的对照株细胞的染色体数目均为2n=2x=16（见图三、四、五）。

实验结果说明0℃处理和8℃处理诱导大蒜根形成多倍体的效果不明显或几乎无效。

经过2℃和4℃处理48h的诱导株染色体数目均为2n=2x=16（见图七、图九），2℃和4℃处理96h的诱导株出现四倍体细胞，染色体数目为2n=4x=32（见图八、图十）。

经过秋水仙素处理的对照株细胞有的染色体数目为2n=4x=32，还可观察到有的细胞染色体数目为2n=8x=64(见图六)。

以上实验结果说明2℃和4℃处理96h能诱导大蒜根形成多倍体，和秋水仙素处理有类似的效果。

三、讨论
1. 对照组一的大蒜在室温下用清水培养，作为空白对照。

新根形态正常，粗细均匀，取根尖分生区组织压片染色后，经镜检可见大蒜的二倍体细胞染色体数为2n = 2x =16。

2. 对照组二的大蒜用秋水仙素培养，作为诱导出的多倍体对照。

秋水仙素的水溶液直接作用于根尖生长点，可以获得较高的多倍体诱变率。

形态学观察可见根尖明显膨大，这是由于染色体加倍使遗传物质增多，细胞体积也相应增大所致。

取根尖分生区组织压片染色后，经镜检可发现许多诱导出的多倍体细胞，在本次实验中观察到处于有丝分裂前、中期的四倍体（2n =4x =32）和八倍体（2n = 8x =64）的细胞，八倍体细胞的产生是因为秋水仙素浓度低对细胞没有致死性，细胞还可以进行分裂，而且处理时间（36h）足够细胞连续分裂两次。

3. 对大蒜进行0℃和8℃处理48h和96h，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，并没有出现较明显的根尖膨大等现象，取根尖分生区组织进行压片染色后镜检也未发现多倍体细胞。

该结果说明0℃和8℃的低温处理并不能诱导大蒜根形成多倍体，至少说明这样的处理诱导多倍体的效果并不明显。

初步分析0℃处理下多倍体诱导效果不佳可能是由于温度过低，容易对植物机体造成伤害，植物可能更多的进行抗冻活动而不是进行细胞分裂生长；8℃的诱导效果不佳则可能是因为温度稍高，已超出能使微管解聚的作用温度范围。

对大蒜进行2℃和4℃的低温处理48h后，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，并没有出现较明显的根尖膨大等现象，取根尖分生区组织进行压片染色后镜检也未发现多倍体细胞。

该结果说明2℃和4℃的低温处理48h并不能诱导大蒜根形成多倍体，至少说明这样的处理诱导多倍体的效果并不明显。

对大蒜进行2℃和4℃的低温处理96h后，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，从外观形态上可见新根与室温下培养的对照组一的根尖相比出现明显膨大，而类似于用秋水仙素培养的对照组二（详见文中所附照片）；取根尖分生区组织压片染色后，经镜检发现处于有丝分裂前、中期的多倍体细胞，一般诱导出的是四倍体（2n = 4x = 32）。

该实验的结果表明，经2℃和4℃的低温处理96h可以使大蒜新发的根诱导出多倍体，且效果较为明显。

2℃和4℃低温处理能够诱导出多倍体，但以低温处理96h为宜，原因是低温能使微管解聚，细胞周期一般为10-30小时，但随温度而变，如豌豆根尖细胞在9℃时为55小时，30℃时为14小时。

在本次试验中，2℃和4℃处理48h没有诱导出多倍体，可能是由于时间太短，细胞无法完成一次细胞周期，低温处理96h可明显看到诱导出多倍体。

微管是细胞的有丝分裂中染色体的运动的动力源泉，微管的活动造成了染色体在
有丝分裂后期的向两极的移动。

低温引起了微管的解聚，从而使有丝分裂进入后期时染色体不能正常的被微管活动拉向两极，由此形成多倍体细胞。

经过一系列不同低温和处理时间实验的研究，并对不同的低温处理作了比较，我认为人教版教材中将《低温诱导植物染色体数目变化》实验作为学生实验是具有一定可行性的，但是的做出相应的改进。

首先是实验材料，人教版教材中选用的是洋葱，本次试验选用的是大蒜。

因洋葱和大蒜都属于百合科葱属，并且大蒜个体小、出根多、好培养，因此可选择大蒜替代洋葱。

其次是实验处理，人教版教材中选取的是4℃低温处理36h，经过比较不同温度和处理时间的实验结果，我认为应该把实验处理改为2℃或者4℃低温诱导，低温处理的时间以96小时为最适。

通过重复实验可以认为此处理具有可操作性和重复性，如果安排学生实验，只要教师做好实验处理，学生能够掌握植物染色体标本的制备技术，在显微镜下就很容易看到低温诱导植物染色体数目变化的现象。