木薯酒精发酵实验 生物101班-20130513

木薯酒精发酵实验

一、实验目的

掌握酒精发酵的基本原理。

二、实验原理

酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。酒精发酵的类型有3种：即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下，丙酮酸则继续分解为乙醇。而如果在碱性条件或者培养基中加有亚硫酸盐时，则发酵的主要产物是甘油，这也是工业的甘油发酵。因此，如果要用酵母进行酒精发酵，就必须控制发酵液的微酸性条件。

三、实验材料

1. 菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16

2. 培养基

① YPD（Y east extract P eptone D extrose）broth：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH，115℃灭菌20min。用于种子培养。

②YPD Agar: YPD加1.5-2%(w/v) Agar，用于斜面（菌种活化）。

③木薯粉发酵培养基：料水比(1：2.3) *的木薯粉，经液化糖化，调节pH至4.5，添加相应营养盐至终浓度为MgSO4·7H2O 0.45g/L，KH2PO4 1.5g/L，CaCl2 0.2g/L，115℃灭菌20min，冷却，添加NH4Cl 0.6g/L至灭菌醪液中。

(*配置150mL发酵酒精度为6%(v/v)的发酵培养基，每瓶需木薯粉21.72g。每人一瓶，150mL培养基装于500mL三角瓶中。)

3. 溶液及试剂

①2.5g/L的标准葡萄糖溶液：称取105℃左右烘干至恒重的葡萄

糖2.5g，加水溶解，加浓盐酸5mL，蒸馏水定容至1000mL容量瓶。提前2-3天配好备用。

②用NH4Cl代替尿素，使用时终浓度为0.6g/L。

③菲林甲液：34.65g硫酸铜加蒸馏水定容至500mL。

④菲林乙液：173g酒石酸钾钠加50g氢氧化钠，加蒸馏水定容至500mL。

⑤质量分数为20%的HCl溶液(总糖的测定-消化)：浓盐酸257mL，定容至500mL容量瓶中。

⑥2mol/L H2SO4溶液(调发酵液pH)：吸取浓硫酸5.6mL缓慢加入适量水中，冷却后定容至100mL。

⑦200g/L NaOH溶液(总糖的测定-消化)：100g氢氧化钠定容于500mL容量瓶中。

⑧2mol/L NaOH溶液(酒精度测定)：4g氢氧化钠定容于50mL容量瓶中。

⑨亚甲基兰溶液（1%，w/v）:

⑩消泡剂

4.主要药品与试剂来源见表 1

表 1主要药品与试剂

Table 1 Main chemicals and reagents 产品名称规格产地/厂家

葡萄糖AR 天津市科密欧化学试剂有限公司

酵母浸膏BR 广东环凯微生物科技有限公司

细菌学蛋白胨BR 广东环凯微生物科技有限公司

磷酸二氢钾AR 广东光华化工厂有限公司

无水氯化钙AR 广东台山市化工厂有限公司氯化铵AR 广东台山市化工厂

七水硫酸镁AR 广东台山粤侨试剂塑料有限公司

氢氧化钠AR 天津市大茂化学试剂厂盐酸AR 广东汕头市西陇化工股份有限公司

硫酸AR 广东省汕头市西陇化工股份有限公司酒石酸钾钠AR 天津市大茂化学试剂厂硫酸铜AR 天津市大茂化工试剂厂

次甲基蓝AR 天津市北联精细化学试剂有限公司

5. 主要仪器设备

本试验所使用的主要仪器设备见表2。

表 2 主要仪器设备

Table 2 Main instruments and equipments 产品名称规格产地/厂家

全温度恒温调速摇床

柜

101-3型

微电脑控制生化培养

箱LRH－250

－Ⅱ

广东省医疗器械厂

电子天平T－500 美国双杰兄弟（集团）有限公司电子分析天平AB104－N 梅特勒－托利多仪器（上海）有

限公司

酒精浓度计MC 河北武强县同辉仪表厂

全自动新型鼓风干燥

箱

ZFD－5230 上海智城分析仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌器LS-B35L-I

不锈钢电热蒸馏水器15KW－20L 上海博讯实业有限公司医疗设备

厂

光波炉YS－A007B 广东省茂名市亚洲电器有限公司旋涡混合器XW－80A 上海精科实业有限公司

四、方法步骤

1 酿酒酵母GGSF16发酵性能的测定

（1）酵母菌种培养流程

酵母菌种培养流程：试验室保藏菌种——斜面活化——一级种子培养——接种发酵

斜面活化：无菌操作将试验室保存的酵母GGSF16接种到斜面培养基上，32℃培养1d-2d。

（2）酿酒酵母GGSF16木薯粉酒精发酵性能的测定称取过40目筛的木薯粉以料水比1：2.3的比例混合于60℃的自来水中，按10U/g木薯粉的量加入液化酶，搅拌混匀后60℃下保温30min。迅速升温到90℃，保温液化1.5h后，于115℃灭菌30min，然后冷却至室温。以2mol/L H2SO4调pH至4.5，按NH4Cl 0.6g/L(称1.56g，加蒸馏水溶解即可)，MgSO4·7H2O 0.45g/L（称1.17g，加水量同上），KH2PO41.5g/L（称3.9g，加水量同上），CaCl20.2g/L（称0.52g，加水量同上）的量加到醪液中，加入150U/g木薯粉的糖化酶。按接种量为10％接种酿酒酵母GGSF16至液化糖化后的醪液中，分别取样10mL置于两个三角瓶中用于测定初总糖和初还原糖。余下的分装到15个三角瓶，分别接上发酵栓，称重，并于33℃发酵，转速为120r/min，摇床培养24h，期间定时称重。发酵结束后，测定酒精度，残总糖和残还原糖。

2. 分析方法

2.1还原糖的测定