发育生物学实验指南简要

实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

一、目的要求

1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。

2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。

3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。

二、材料与设备

1．动物：SD大鼠。

2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱

三、实验步骤

1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:

⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：

①以颈髓离断法处死小鼠。在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。

②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。

③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。

④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。

2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。

实验二大鼠神经干细胞的分离培养

一、目的要求

1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。

2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。

3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。

二、材料与设备

1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠

2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。

3．主要器材与仪器：青霉素瓶，手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，注射器，小弯镊，CO2恒温培养箱，倒置相差显微镜等。

三、实验步骤

1．取孕龄约15天的孕鼠一只，腹腔麻醉后，用70％乙醇消毒腹部皮肤，剪开腹部皮肤及打开腹腔，取出子宫，转入冰盆上盛有约D-Hank’s液的培养皿中。

2．从子宫中取出胚胎，转入另一盛有D-Hank’s液的培养皿中，仔细分离，剪下三个脑泡，去处脑膜及血管后，放入装有1ml D-Hank’s液的小青霉素瓶中。

3．用眼科剪反复剪碎脑组织，加入0.25％的胰蛋白酶约1ml ，37℃消化20分钟后，用血清5-10滴中止消化，1000r/min离心5min，弃上清，加入5-6ml条件培养基，吹打细胞，收集单细胞悬液，将其种于装有条件培养基的培养瓶中，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。

4. 带学生在电脑上观看以往的小鼠神经干细胞免疫荧光图片。

实验三大鼠胚胎标本的制作

一、目的要求

1．掌握大鼠胚胎的取材和固定，HE染色方法。

2．了解大鼠胚胎的包埋和切片方法。

二、材料与设备

1. 动物：孕鼠

2. 取材用具：麻醉剂注射器帆布手套手术手套搪瓷盘眼科剪眼科镊大直剪有齿镊

金属镊棉球烧杯酒精灯70%酒精200 ml 固定液广口瓶

3. 染色用具：胚胎组织石蜡切片玻璃瓶漏斗染色缸树胶瓶盖玻片

三、实验步骤

1.HE染色程序

脱蜡二甲苯①20-30min

脱蜡二甲苯②20-30min

100%酒精① 5 min

100%酒精② 5 min

95%酒精 5 min

80%酒精 5 min

水洗1min

苏木素10-15min

水洗1min

1%盐酸酒精15sec

流水冲洗15-30min

伊红10-15min

80%酒精过一道

95%酒精3-5 min

100%酒精①10-15 min

100%酒精②10-15 min

透明二甲苯①10-15 min

透明二甲苯②10-15 min

中性树胶封片

2.带学生在二楼实验室观看胚胎标本HE染色图片。