PCR技术的原理操作及应用解读

用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ul PCR产物 上样至胶中。 100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。
PCR扩增产物检测 2
PCR扩增产物检测及结果判定
PCR技术的注意事项
防止污染，建立良好的质量控制，避免污染。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 设置对照： PCR反应针对模板有阳性/阴性对照
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 模板DNA 引物 4种dNTP混合物 Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双蒸水至 5 ul 0.1～2 ug 各10～100 pmol 各200 umol/L 2.5 U 1.5 mmol/L 50 ul
可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化 按照实验方案进行即可

简便、快速、自动化
1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析

对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
PCR技术的局限性
为了构建特定引物，使特定DNA序列的选 择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的 数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的 因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。
PCR技术的原理 2
基本原理
DNA的半保留复制原则 碱基互补配对原则
T—A T —A
G—C C—G A—T A-T
A-T A—T C—G G—C G-C A
A=T，G=C
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分 子为模板，以一对分别与模板互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用 下，按照半保留复制的机理沿着模板链延 伸直至完成新的DNA合成。
PCR循环参数
（热力学参数） 94 ℃，3min； 94 ℃，45s； 58 ℃，1min； 72 ℃，1min；循环30次 72 ℃，10min； 16 ℃保温
94 ℃预变性，3min 使DNA双链完全打开 变性： 94 ℃变性，45s 使双链DNA解链为单链
94 ℃，3min； 94 ℃，45s； 退火： 58℃，1min 58 ℃，1min； 循环30次 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特 72 ℃，1min； 异性结合，降低温度可增加反应的 72 ℃，10min； 灵敏性。 16 ℃保温
1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。
PCR技术的原理 1
遗传物质：
细胞核 染色体 DNA（脱氧核糖 核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋 排列的，碱基序列的长度和排列 的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对， 按上述的0.1%的差，人和人之间 有3百万个碱基对的差别。 DNA双螺旋结构和遗传密码子的发 现，开创了分子生物学的时代。
T A -T G—C C—G A—T A-T A-T A—T C—G G—C G—C
T
A
A—T
G—C C—G A—T A-T A-T A—T C—G G—C G—C
PCR技术的原理 3
PCR反应的体系
包括7种基本成分： 模板 （Template DNA） 引物 （Primer） Taq DNA聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液 （Taq Buffer）
延伸：72 ℃，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 ℃ 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB
PCR扩增产物检测 1
凝胶电泳缓冲液配方
10×TBE缓冲液(每升) ：Tris107.8g Boric Acid55.0g EDTA(Na2)8.2g 10×TAE缓冲液(每升) ：Tris48.4g 冰乙酸 11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml
Jeffreys命名这一技术为DNA指纹技术（DNA finger print）。
DNA指纹技术 2
采集血样（毛发、精 液、口腔粘膜细胞）， 分离DNA，用PCR将 选定的DNA片段放大， 并进行对比，统计分 析，便可得出是否为 作案凶手或是否有血 缘关系。
分子诊断学
分子诊断学是以分子生物学理论为基础， 利用分子生物学的技术和方法研究人体内 源性或外源性生物大分子和大分子体系的 存在、结构或表达调控的变化，为疾病的 预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息 和决策依据 。
分子诊断学的发展阶段
分子诊断学大致经历了3个阶段：
（1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； （2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和 实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA 和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中 mRNA的表达量 （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型 检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片， 组织芯片等 。
PCR技术的原理 4
基本反应步骤 ：
变性(denaturation) -高温下将模板DNA双链打开
退火(annealing) -引物在较低温度下以共价键结
合到模板DNA互补部位
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延伸(extension)
-Taq酶作用下，不断向引物3’
端添加dNTP，DNA链不断延伸
PCR技术的原理 5
以温度变化来控制反应阶段 1 2 3
分子生物学
PCR技术的原理、操作及应用
西南大学 生命科学学院 范迪 2013.04.11
什么是PCR
PCR: Polymerase Chain Reaction，即聚合酶 链式反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技 术
PCR技术的发展历史
1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶 （生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命 名为第一个“年度分子”。
阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性 阴性：验证PCR反应有无污染
PCR技术的应用
基因克隆、测序和表达等 法医学个体识别和亲子鉴定 遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测 等
基因克隆和表达
DNA指纹技术 1
1984年英国的遗传学家Alec Jeffreys在进 行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发 现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上 重复着一种小片段DNA，这一含15个左 右碱基的DNA片段，在不同个体间重复 的频率及位置有明显的不同，Jeffreys首 先在自己的DNA上进行研究，验证了这 一技术，如果我们有血缘关系，这些不 同会大大缩小。
94
温 度 （℃）
高温变性 低温退火 适温延伸 形 成
重复1~3步 25~35轮
72 55
DNA 2
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
目的DNA片段 扩增100万倍以上
22
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR技术的优点
优点:
特异 灵敏度高
1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU