第二节 分光光度法
分光度光度法
分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法
( C )2. 用普通分光光度法测得标液c1的透光度为20%， 试液的透光度为12%；若以示差分光光度法测定以c1 为参比，则试液的透光度为
A. 40% B. 50%
C. 60%
D. 70%
( D )3. 按一般光度法用纯溶剂做参比溶液时，测得某试 液的透光度为10%。若参比溶液换为透光度为20%的
(×) 4. 有色溶液的吸光度为0，其透光率也为0。
1.5 吸 光 系 数
吸光系数K物理意义：吸光物质在单位浓度、 单位厚度时的吸光度。
1. 质量吸光系数 c单位g/L，b单位cm，K单位L ·g-1 ·cm-1 A = Kbc
2. 摩尔吸光系数 c单位mol/L，b单位cm，ε单位L ·mol-1 ·cm-1 A = εbc
1.4 光吸收基本定律—朗伯比尔定律
( ✓)1. 朗伯－比耳定律的应用条件：一是必须使
用单色光；二是吸收发生在均匀的介质；三是吸 收过程中，吸收物质相互不发生作用。
(×) 2. 有色物质的吸光度A是透光度的倒数。 (×) 3. 在分光光度分析中，入射光强度与透射光
强度之比称为吸光度，吸光度的倒数的对数为透 光率。
( ✓)1. 如果显色剂有色，则要求有色化合物与显色剂
之间的颜色差别要大，以减小试剂空白值，提高测定 的灵敏度。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称 为“对比度”。一般要求显色剂与有色化合物的对比 度在∆λ60nm以上。
( ✓)2. 分光光度法中，可选择不同厚度的比色皿以
控制吸光度在合适范围内。
1.5 吸 光 系 数
摩尔吸光系数ε意义： 1）吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。 3）可作为定性鉴定的参数。 4）同一物质在不同波长下的ε值不同。
§2.2 双波长和三波长分光光度法
2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
A B A B A 、 A 和 A 、 A 2 1 1，则 2
S＝K2 A2＋K2 A2－K1 A1－K1 A1
调节仪器中的信号放大 器，使干扰组分B在波长λ2 和λ1处的信号相等，由此得 系数倍率K为：
第二节 双波长和三波长分光光度法 一．双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发 展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混 浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确 测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析， 也很难得到准确的结果。 双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长 法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵 敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提 高。
二． 三波长分光光度法的原理和应用
1．基本原理
如图所示，在任一吸 收曲线上，可以在任意选 择的三个波长处测量吸光 度。根据三角形和三角形 相似，可推导出在上述三 个波长处测量的吸收度具 有下列函数关系： 三波长法原理图
式中，m和n分别表示(2 -1)和(3 -2)的数值。1、2和3 分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数；C为待测物的摩尔浓 度；b为光程。方程中的系数 可预先求得，A值 与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的 含量。 从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处 于一条直线上，则测得的A值为零。因此，当干扰组分的吸收 光谱为一直线（如浑浊产生的干扰），则在任选的三个波长处 测定，测得的值与干扰物浓度无关，如果干扰物为一吸收曲线， 只要在曲线上找到处在一条直线上的三点，在此三点相应的波 长处测定，由于干扰物在此三波长处的值为零，故测得的只与 待测组分的浓度有关。
分光光度法
第二节分光光度法(一)基础知识分类号：P2-O一、填空题1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的，对待测组分进行定量测定。
答案：吸光度(或吸光性，或吸收)2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案：符合程度3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。
可用涮洗，或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。
答案：相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案：正确2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。
( )答案：正确3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案：错误正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案：错误正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。
5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案：错误正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A．所用试剂的纯度不够的影响B．非吸收光的影响C．非单色光的影响D．被测组分发生解离、缔合等化学因素答案：A2．分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A．之和B．之差C．乘积答案：B3．分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标，一般常用标准溶液进行吸光度校正。
分光光度法 科普
分光光度法科普分光光度法（Spectrophotometry），简称分光法，是一种广泛应用于生物、化学、医药等领域的分析技术。
它基于物质对不同波长光的吸收或透射性能，通过测量光的强度变化来定量或定性分析物质的浓度。
本文将介绍分光光度法的原理、仪器配置以及应用。
一、原理分光光度法的原理基于比尔－朗伯定律（Beer-Lambert Law），该定律描述了物质溶液对单色光的吸光度（Absorbance）与物质的浓度以及溶液的光程（即光线通过溶液的路径长度）成正比的关系。
其数学表达式为：A = ε×c×l，其中A表示吸光度，ε是摩尔吸光系数，c是物质的浓度，l是光程。
当物质吸收一束光时，其吸收强度与入射光强度呈指数关系。
通过对不同波长的光通过物质溶液后，测量出透射光的强度变化，可以推算出物质的浓度。
二、仪器配置分光光度法常用的仪器是分光光度计，主要由光源、单色器、样品池、检测器和信号处理器组成。
1. 光源：分光光度计使用的光源通常是白炽灯或者氘灯。
白炽灯可以发出连续谱的光，而氘灯通常用于紫外光区域的分析，因为氘灯可以发出紫外光谱。
2. 单色器：用于将连续谱的光分解为单色光，常见的单色器有棱镜和光栅。
棱镜通过光的折射来将光分解为不同波长，而光栅则是通过光的衍射来实现。
3. 样品池：用于盛放溶液样品，通常是石英或玻璃制成。
不同颜色的玻璃样品池会对特定波长的光产生吸收，因此石英或透明玻璃是更好的选择。
4. 检测器：分光光度计常用的检测器是光电二极管或光电倍增管。
光电二极管可以将光转化为电信号，并输出给信号处理器。
5. 信号处理器：用于接收检测器发出的电信号，将其转化为可读的吸光度值，并进行数据处理。
三、应用分光光度法在许多领域都有着广泛的应用。
1. 生物学领域：在生物学研究中，分光光度法可以用于分析DNA、蛋白质、酶活性等。
例如，通过测量DNA溶液对260nm波长的紫外光的吸光度，可以估算出DNA的浓度和纯度。
分光光度法的原理
分光光度法的原理分光光度法是一种常用的分析化学方法，它通过测量溶液中物质对特定波长的光的吸收或透射来确定物质的浓度。
这种方法在化学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用，是一种非常重要的分析技术。
分光光度法的原理基于比尔定律，即溶液中物质对光的吸收与物质的浓度成正比。
当一束光通过溶液时，溶液中的物质会吸收部分光线，其吸收量与物质的浓度成正比。
根据比尔定律，吸光度与浓度之间存在线性关系，因此可以通过测量吸光度来确定溶液中物质的浓度。
分光光度法的核心设备是分光光度计，它能够测量样品对特定波长光的吸收或透射。
在进行分光光度测定时，首先需要选择适当的波长，使得样品对该波长光具有较大的吸光度。
然后将样品置于分光光度计中，测量其吸光度。
根据比尔定律，可以通过吸光度与浓度的线性关系来计算样品的浓度。
分光光度法的优点之一是其灵敏度高，可以测量极微量的物质。
此外，分光光度法还具有快速、准确、简便的特点，适用于各种类型的溶液样品。
因此，分光光度法在实验室和工业生产中都得到了广泛的应用。
在实际应用中，分光光度法还可以与其他分析方法相结合，如色谱法、电化学法等，以提高分析的准确性和可靠性。
此外，分光光度法还可以用于监测环境中的污染物质、检测生物样品中的代谢产物等，具有重要的环境和生物应用价值。
总之，分光光度法是一种重要的分析化学方法，它基于比尔定律，通过测量溶液中物质对光的吸收或透射来确定物质的浓度。
分光光度法具有灵敏度高、快速、准确、简便等特点，在化学、生物学、环境科学等领域有着广泛的应用前景。
通过不断的技术创新和方法改进，分光光度法将会在更多领域发挥重要作用，为科学研究和工业生产提供有力支持。
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法专业知识课件
E1’ molecular vibration E1’’ molecular rotation E0 Ground level
互补（色）光
complementary colors
第一节 分光光度法 基本原理
若溶液选择性地吸收了某种颜色旳光， 则溶液呈吸收光旳互补色。
二．物质旳吸收光谱
用不同波长旳单色光依次
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度替代c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
常用参比溶液
成份 溶剂 显色剂
溶剂空白 √ ×
试样
×
其他 合用范 围
× 显色剂、试 样均无吸收
试剂空白 √ √ 试样空白 √ ×
×
√ 试样无吸收 显色剂有吸
收
√
√ 显色剂无吸 收，试样有
吸收
第四节
提升测量敏捷度和精确度旳措施 自学 要点看： 分光光度法旳误差起源 显色剂旳选择 测定条件旳选择
本章小结
As，在相同条件下测出试样溶液旳吸光度 Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：
Ax /As= cx / cs cx = cs Ax /As
参比（空白）溶液 blank
I 参比溶液旳作用：扣除一切不起源于 目旳产物旳光吸收。
如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物旳影响。
常用参比溶液：
①溶剂空白 ②试剂空白 ③试样空白
分光光度法原理
分光光度法原理分光光度法是一种常用的分析化学方法，它通过测量样品对特定波长的光的吸收或透射来确定样品中特定物质的浓度。
该方法广泛应用于药品分析、环境监测、食品安全等领域，具有操作简便、准确性高的特点。
分光光度法的原理是基于比尔定律，即溶液中溶质对单色光的吸收与其浓度成正比。
当光线通过溶液时，溶质吸收部分光线，其吸收量与浓度成正比。
通过测量吸收光强度的变化，再根据比尔定律计算出溶质的浓度。
在实际操作中，分光光度法通常使用分光光度计进行测量。
分光光度计通过选择特定波长的光源，使其通过样品溶液，然后测量出射光的光强度。
根据比尔定律，吸光度与浓度成正比，因此可以通过测量吸光度来确定溶质的浓度。
分光光度法的优点在于操作简便、测量速度快、准确度高。
同时，该方法还可以应用于多种溶液和固体样品的分析，具有较强的通用性。
因此，分光光度法在化学分析领域得到了广泛的应用。
然而，分光光度法也存在一些局限性，比如在样品中存在多种吸收物质时，会导致吸收光谱的叠加，难以准确测定各种物质的浓度。
此外，溶液的颜色、浑浊度等因素也会影响测量结果的准确性，需要进行适当的处理和校正。
总的来说，分光光度法是一种重要的分析化学方法，它通过测量溶质对特定波长光的吸收来确定其浓度，具有操作简便、准确度高的优点。
在实际应用中，我们需要充分了解该方法的原理和操作技巧，以确保测量结果的准确性和可靠性。
同时，也需要注意分光光度法的局限性，避免在实际应用中出现误差。
通过不断的学习和实践，我们可以更好地掌握分光光度法，并将其应用于化学分析实践中，为科学研究和工程实践提供有力支持。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
分光光度法ppt课件
A
0.7 0.2
3.显色剂
显色剂的选择
• 灵敏度高,ε值大于104 • 选择性好 • 有色物组成确定且稳定 • 显色剂在测定波长处无明显吸收 显色条件的选择 •酸度 •显色剂用量
•显色时间和温度
（1）溶液的酸度 M+HR===MR+H+
* 影响显色剂的平衡浓度和颜色 * 影响被测金属离子的存在状态 * 影响络合物的组成 * pH与吸光度关系曲线确定pH范围。
B
电子能级
转动能级
振动能级
A
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
由于光子的能量也是量子化的，所以 分子对光的吸收也是量子化的，即分 子只选择吸收能量与其能级间隔一致 的光子而不是对各种能量的光子普遍 吸收。
分子吸收光能后引起运动状态的变化称 为跃迁，跃迁产生吸收光谱
以吸收光强度为纵坐标,以波长为横 坐标作图,所得曲线即吸收光谱曲线
解：Cd的原子量为112.4，则
140×10-6
C Cd2+ = 112.4
=1.24×10-6mol·L-
A=εbc
ε =A/bc
0.220
ε=
=8.87×104 L·mol-1cm-1
2×1.24×10-6
朗伯-比尔定律的适用条件
1. 单色光
应选用max处或肩峰处测定
2. 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)
λ
电磁波谱
Hale Waihona Puke 二、物质对光的选择性吸收溶液呈现不同的颜色是由于它对不同 波长的光具有选择性吸收而引起的.用 白光照射某有色溶液,呈现出的是透射 光颜色.吸收的色光和透过光称为互补 色光.
紫外可见分光光度法
波长和颜色的关系
λ（nm） 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
二、物质对光的选择性吸收
1、物质对光的吸收的本质
定性分析： 1、与标准品或标准图谱对比，鉴定未知物； 2、鉴别异构体 如：顺反异构、互变异构（如酮-烯醇式） 3、纯度检查
定量分析： 1、单一组分测定 2、多组分同时测定
第二节 紫外可见分光光度计
一、紫外可见分光光度计的构造
光源
单色器 吸收池
检测 系统
信号显 示系统
（一）光源
1、作用：提供符合要求的入射光。
3、分类： （1）可见光光源：
①钨丝灯：是最常见的可见光光源，它可发射波长 为325-2500nm范围的连续光谱，其中最适宜的使 用范围是320-1000nm，除用作可见光源外，还可 用作近红外光源。
②卤钨灯
在钨丝中加入适量的卤化物或卤素，灯泡用石 英制成，具有较长的寿命和高的发光效率。
（2） 紫外光光源： 多为气体放电光源，其中应用最多的是氢灯和
➢ 以光的衍射现象和干涉现象为基础（平面反射光栅和平面 凹面光栅）Βιβλιοθήκη （三）吸收池（又称比色皿）
1、作用：盛装被测溶液和参比溶液。 2、分类： （1）玻璃比色皿：适用于可见光区。（能否用于紫 外光区？） （2）石英比色皿：适用于紫外及可见光区。
3、主要规格： 0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等。
紫外可见分光光度计基本组成
钨灯卤素 灯或氘灯
棱镜或光 栅，玻璃 或石英
分光光度法基本原理
能级跃迁
紫外-可见光谱属于电子跃迁光谱。 电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
讨论：
（1）转动能级间的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱； （2）振动能级的能量差ΔEv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱； （3）电子能级的能量差ΔEe较大1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电子光谱
二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为：
朗伯—比耳定律数学表达式
A＝lg（I0/It)= εb c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１； 或: A＝lg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位g·L－１ a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１ a与ε的关系为： a =ε/M （M为摩尔质量）
三、分子吸收光谱与电子跃迁
1．紫外—可见吸收光谱 有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。
分光光度法讲义
分光光度法云南先锋化工有限公司质量监测中心1、分光光度法引言（1）概念：分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
（是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。
）（2）阐述概念：在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
（3）特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。
对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。
（4）波长范围(1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区，(3)2.5～25μm(按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>)的红外光区。
2、分光光度法的原理• Lambert 定律：一束单色光在通过透明溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大，光线强度的减弱也越显著，即光吸收的量与溶液的厚度成比例关系。
若以I 0表示入射光强度，I 表示透过光强度，L 表示溶液的厚度，而I/ I 0表示光线透过溶液的程度，称为透光率，用T 表示，则T= I/I 0。
K 为消光系数，在入射波长、溶液种类和温度一定的条件下，K是一个定值。
• Beer 定律：一束单色光在通过透明溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著，即溶液对光的吸收与溶液的浓度成比例关系。
分光光度法 PPT
（2）. 单色器(monochromator)：将光源发出的连
续光谱分解为单色光的装置。
棱镜 光栅
玻璃350 ～ 3200 nm, 石英185 ～ 4000 nm
26
（3）.吸收池(cell):用于盛待测液及参比溶液 玻璃 — 能吸收UV光，仅适用于可见光区
(3) 操作简便快速，仪器设备简单。 (4) 应用广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物都 可直接或间接地用吸光光度法进行测定。
6
物质对光的选择性吸收 （1）.光的基本性质
电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。 远紫外 近紫外 可见
(真空紫外)
近红外 中红外 远红外
10nm~ 200nm
200nm ~400nm
42
c
0.434T c T lg T
若透光度刻度的读数的绝对误差为∆T=1%，用不同的T 代入上式，可得相应浓度测量的相对误差∆c/c，作图。
10
c
c
(%)6
4 2
8
0.368
0
0.2 0.4 0.6
0.8 1.0 T
由图可见： 1、T = 36.8%(A =0.4343)，相对误差最小。 2、T在20%～65%(A=0.2～0.7)范围，相对误 差较小。 为了减小浓度的相对误差，提高测定的准 确度，一般应控制溶液吸光度A在最适宜读数 范围1.0～0.15。
17
入射光 I0
透射光 It
①. 朗伯定律(Lambert’s law)
A=lg(I0 /It )=Kb
②. 比尔定律(Beer’s law)
A=lg(I0 /I t )=Kc
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
分光光度法.ppt
提高测量灵敏度和准确度方法
二、提高测量灵敏度和准确度方法
（一）、选择合适显色剂 （1）灵敏度高 >104 （2）选择性好 只与被测物显色 （3）生成的有色物稳定、组成一定 （4）显色剂在测定处无明显吸收
提高测量灵敏度和准确度方法
（二）、选择合适测定条件
第三节 可见分光光度法
一、分光光度计 光源 单色器 吸收池 检测器
显示器 二、单组份测定方法 （一）、标准曲线法
信号放大器
可见分光光度法
（一）标准曲线法:
Beer’s law 当,b等一定，A与C成正比，A=KC
取标准品配置一系列不同浓
A
度的标准溶液，置于液层厚
度相同吸收池，测定相应吸
Ax
光度，以A~C作图，得一条
三、吸收光谱
吸收光谱：A ~ 作图
A:吸光度，物质对单色光的吸收程度
Hale Waihona Puke 吸光度最大处的波长为最大吸收
波长，用max表示。 max是定性鉴别物质的基础 不同浓度的溶液，max不变，浓度
与峰值成正比，这是进行定量分析
的依据。
一般用max单色光测定
A
C2﹥C1
(2)
(1)
max
第二节 分光光度法基本原理
一、Lambert-Beer law
3.某含铁约0.20％的试样，用邻二氮杂菲亚铁光度法ε=（１.１×104）测 定，试样溶解后稀释至100ｍL，用1.00cm的比色皿，在508nm波长下测 定吸光度。为使吸光度的测量引起的浓度相对误差最小，应当称取试样 多少克。（MFe=55.85）
3.丁二酮肟对含镍量为0.12%的某试样进行比色分析测定，若配制100毫升 试液，波长470nm处用1.0厘米的比色皿进行测定，计算当测量误差控制在 最小时，应称取试样多少克？(已知：ε=1.3×104，MNi=58.69)
第二章分光光度法
第五节 测量误差和测量条件的选择
•
1、测量误差 许多误差来自吸光度的定量测定。光度测定过程 包括两个阶段：第一阶段是化学过程，即利用各种 化学反应将待测组分的溶液用适当的试剂处理，使 待测组分转变为一定组成的化合物，包括有色化合 物及各种络合物；第二阶段是物理过程，即将经第 一阶段处理的样品置于仪器中测定吸光度或绘制吸 收光谱。因此，测定过程中的误差可以分成: • 化学误差 • 仪器的误差 • 人为的误差
第七节 分光光度计
•
1 、分光光度计
• 仪器简介
任何类型的分光光度计都配备下列组成部 分：光源、单色器、吸收池、检测器和显示 仪表等。 国内比较常用的紫外－可见分光光度计有 单光束和双光束两种类型。
24
仪器的装置原理
单光束装置
光源 单色仪 空白或样 品吸收器 空白 检测器
单光束分光光度计
双光束装置
分光光度法
1概述 2朗白比尔定律 3显色反应 4显色剂
5测量误差及测量条件
6示差分光光度法 7分光光度计
1
h
c c
第一节 分光光度法概述
1、电磁辐射
光是电磁辐射。电磁辐射具有粒子的性质，也具 有波动的性质，其波动性可用波长（）来表示 。所谓波长即指在波传播路线上具有相同振动位 相的相邻两点之间的距离。电磁辐射的粒子性的 主要特征是每个光子具有能量，其与波长之间的 关系为：
＝ｈ•ｃ/λ 。
2
电磁辐射按波长顺序排列，称为电磁波谱
波长范围 0.0001～10nm 频率范围(MHZ) 3×1014～3×1010 跃进能级类型 核能级 内层电子能级 0.005～0.14nm 6×1014～2×1012
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4V5560.2.38717043 =2.40×102 Lmol-1cm-1
A415 4T1ib5 cT i 4V1b5 cV
cTi 5.39104mol/L cV 1.26103mol/L
A455 4T5ib5 cT i 4V5b5 cV 原 cTi5.3 91 0 452.6 71 0 3(mo)l
苯和N-亚硝基二甲胺的紫外吸收光谱图
红移与蓝移
➢ 有机化合物的吸收谱 带常常因引入取代基 或改变溶剂使最大吸 收波长λmax和吸收强 度发生变化:
➢ λmax向长波方向移 动称为红移，向短波 方向移动称为蓝移 (或 紫移)。吸收强度即摩 尔吸光系数ε增大或减 小的现象分别称为增 色效应或减色效应， 如图所示。
思考题
1
吸光光度法的定性与定量分析 的基础是什么？
2 分光光度计的基本组成？常用的光源 及单色器？
相同的条件测得A415=0.645, A455=0.553,
求原混合液中钛和钒的浓度。
4T1i5101..403651203 =8.21×102 Lmol-1cm-1
4T5i510.0.26416023 =4.64×102 Lmol-1cm-1
4V1560.2.28511043 =1.60×102 Lmol-1cm-1
可检10-8~10-9s 短脉冲信号
光电二极管阵列
光电二极管阵列 (photodiode array) 检测器为多道光检测 器，可同时检测多个波长的光强度。
优点: 不怕强光、耐振动、耐冲击、小型、重量轻、耗 电少、寿命长、可靠性高及读出速度快等优点，不存在 时间滞后现象，可应用于化学反应动力学研究。
有选择性吸收作用而产生了不同颜色。
光吸收曲线
吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
KMnO4的颜色及吸收光谱
叶绿素的结构和吸收光谱
光吸收的基本定律：朗伯—比尔定律
朗伯—比尔定律适用的条件
吸光度的加和性
例: 钛-H2O2和钒-H2O2络合物的最大吸 收波长分别在415nm和455nm处，取50.00mL 1.06×10-3mol/L钛-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度 分别为0.435和0.246; 取25.00mL 6.28×10-3mol/L 钒-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度 分别为0.251和0.377。取20.00mL钛钒混合 液，加入H2O2显色后定容为100mL，以上述
紫敏光电管阴极表面涂有锑和铯，适用200~625nm 红敏光电管阴极表面涂有银或氧化铯，适用625~1000nm
光电倍增管
光电倍增管(photomultiplier)是由一个光阴极和多个二次 发射电极 (打拿极)和阳极所组成，其灵敏度比光电管要 高得多。
9~12个打拿级
1个光电子可 产生106~108 个电子
测定高浓度试样和混浊试样以及多组分混合物的定量 分析具有很大优越性，提高了测量灵敏度和准确度。
三、显色反应及分析条件的选择
显色反应条件的选择
四、吸光光度法仪器测量误差及其消除 入射光波长的选择
光度计读数范围的选择
参比溶液的选择
溶液浓度的测定
➢工作曲线法 绘制工作曲线； 测样品A，在曲线上获得对应浓度。
常用检测器：光电管、光电倍增管、光电二极管阵列、 光电池、电荷耦合器件。
光电管
光电管 (phototube) 是由封装在真空封套里的一个半圆柱 面形阴极和一个丝状阳极组成。阴极的凹面上有一层对 光敏感的碱金属或其氧化物，受光照射可发射光电子。
当在两极间加上电压时， 即会产生光电流，流经 负载电阻 ( 一般 106~109 ) 时会产生 一定电压降。经放大 后将信号输给指示仪 表或记录仪。
分光光度计类型
单波长双光束分光光度计
特点： (1) 同时测量参比池和样品池， (2) 双单色器，提高分辨率降低杂散光 (3) 自动测量 (4) 附件扩展功能
常用型号：北京普析通用公司TU-1221型/T6，岛津UV2501型，PE的Lambda系列及HP的8453型等。
双光束光度计
动画
(三) 双波长分光光度计 为克服由于非特征吸收信号 ( 如试液混浊引起的散射， 比色皿与空气界面和比色皿与溶液界面的折射差别等) 影响而带来测定误差，而设计双波长分光光度计。
组成：Hale Waihona Puke 射狭缝、准直镜、色散元件、出射狭缝
入射狭缝：限制杂散光进入 色散元件：将复合光分解为单色光，有棱镜和光栅两种 准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上 出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限
制通带宽度。
单色器的性能直接影响射出光的纯度，从而影响测定 的灵敏度、选择性及校正曲线的线性范围。单色器质 量好坏，主要取决于色散元件的质量。
原 cV1.2 61 0 356.3 01 0 3(mo)l
二、光度分析的方法和仪器
721 可见分光光度计
722系列 可见分光光度计
751分光光度计
SP-756P紫外可见分光光度计
单色器
单色器(monochromator) 是一种把来自光源的复合光分 解为单色光，并分离出所需波长光束的装置。
迁产生的R 带。 （3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰（ε=200-
2000），芳环的特征 吸收（具有精细解构的B带）。 （4） 200-250 nm有强吸收峰（ε104），表明含有一
个共轭体系（K）带。共轭二烯：K带（230 nm）； 不饱和醛酮：K带230 nm ，R带310-330 nm 260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，3,4,5个双键的共 轭体系。
➢比较法
五、吸光光度法的应用
六、紫外吸收光谱分析法
波长10～400nm为紫外光，10～200nm为远紫外光， 200～400nm为近紫外光。
有机化合物结构与紫外信息的关系
（1）200-400nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯。 （2） 270-350 nm有吸收峰（ε=10-100）醛酮 n→π* 跃
第二节 分光光度法
常用光谱分析仪器 紫外-可见分光光度计 原子吸收分光光度计 红外光谱仪 原子发射光谱仪 荧光分析仪 原子荧光分析仪等
颜色的产生
如果把适当颜色的两种光按一定 强度比例混合可得到白光，这两 种颜色的光称为互补色光。
物质对光的选择性吸收
➢ 颜色的产生：不同的物质只对不同的、特定波 长的光有较强的吸收。物质对不同波长的光具
检测器
在测量中须把光信号变化转换成电信号的变化才能定量 测量，这种把光信号转换成电信号的装置称为光电转换 器 —— 检测器。 对检测器的要求主要有：
① 产生的电信号必须与照射到它上面的光束的强度 有恒定函数关系；
② 必须能对一个很大的波长范围的光具有响应，否 则应用局限性大；
③ 灵敏度要高，响应速度要快，产生的电信号要易 于检测或放大且噪声要低。