探针的设计原则
探针引物设计原则
TaqMan® MGB探针设计原则
1.探针5' 端的第一个碱基不能是G。
2.用Primer Express®软件计算出来的探针Tm值应当在65-67°C 之间。
3.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。
4.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。
5.尽量使含C多于含G的探针。
如果C少于G，则使用互补链上的探针。
6.如果是SNP，多态位点尽量位于探针中央。
7.基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性
引物的设计原则
1.在探针确定以后再选择引物。
2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。
3.保持G-C含量在30-80%之间。
4.避免同一碱基重复过多。
特别是G，不可超过4个及以上。
5.用Primer Express®软件计算出来的Tm值应当在58-60°C之间。
6.在3’端的5个碱基中，G和C碱基的加起来不要超过2个。
7.扩增片段的长度在50-150 bp间。
emsa探针设计原则
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的实验技术。
在EMSA实验中，DNA与蛋白质结合形成复合物后，由于蛋白质的结合，DNA的迁移速度减缓，从而产生电泳迁移的变化。
设计EMSA 探针时，需要考虑一些原则以确保实验的有效性和准确性。
以下是一些EMSA探针设计的原则：1. DNA序列选择：-选择包含蛋白质结合位点的DNA序列。
-序列长度通常在20到30个碱基对之间。
2. GC含量：-控制DNA探针的GC含量，使其在40-60%之间，以确保适当的二级结构形成。
3. 端标记：-选择适当的标记方法，如放射性同位素标记（如^32P）或非放射性标记（如荧光标记或生物素标记）。
-注意标记效率和探针稳定性。
4. 双链DNA vs. 单链DNA：-双链DNA探针更接近实际生物条件，但单链DNA可能更容易与蛋白质结合。
-根据实验需求选择双链或单链DNA。
5. 非特异性竞争：-添加非特异性竞争DNA片段可以用于确认蛋白质结合的特异性。
-非特异性竞争物质的浓度需要经过优化。
6. 核苷酸突变：-引入特定核苷酸的突变以确认蛋白质结合的特异性。
-突变的核苷酸位置需要根据先前的研究或生物信息学分析来选择。
7. 探针浓度：-确定适当的DNA探针浓度，通常需要进行一系列的浓度测试以确定最佳条件。
8. 探针纯度：-使用纯度高的DNA探针，以避免非特异性结合或其他干扰。
9. 探针长度：-考虑探针的长度，太长可能影响迁移速度，太短可能不足以与蛋白质结合。
10. 实验条件优化：-需要优化电泳条件，如凝胶浓度、电场强度、电泳时间等，以确保蛋白质- DNA复合物和未结合的DNA可以明显分离。
设计EMSA探针时需要根据具体的实验目的和条件进行调整和优化。
在实验过程中，注意控制实验的质量和可重复性，以获得可靠的结果。
qpcr探针设计原则
qpcr探针设计原则
qPCR探针设计的原则有以下几点：
1. 确定靶序列：选择靶序列时，需要确保其能够准确区分目标
基因和其他相关基因，避免干扰。
同时，靶序列长度不应过长或过短，一般在100-250 bp之间。
2. 选择探针类型：常见的探针类型有探针（TaqMan探针、MGB
探针）、探针（SYBR Green探针）。
TaqMan探针在靶序列上会特异性
结合，产生荧光信号，而SYBR Green探针则能够与任何DNA结合并发
出荧光信号。
3. 合理设计探针：探针的设计需要考虑到靶序列的特点，如GC
含量、序列是否存在二级结构、SNP等，以保证探针的特异性和稳定性。
4. 选择合适的引物：引物需要在靶序列上特异性扩增特定片段，同时需要满足一定的比例关系，避免扩增效率过高或过低。
5. 优化PCR反应条件：反应条件的优化包括反应体系、PCR循环参数等方面，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
探针设计的原则是什么？
探针设计的原则是什么？
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
2. 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
3. 扩增长度应不超过400bp，理想的扩增长度在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
5. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G （不能有4个连续的G）。
6. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
在原理上与引物设计是比较类似的。
只是因为探针序列要求匹配度很高，所以对于探针的GC含量和Tm值都是有严格要求的，而且还要考虑到与上下游引物相匹配。
假如你手头已经有了染料法的引物，然后想仍然使用这一对引物、在这一对引物对应的序列中间选一段作为探针可以吗？我们不建议这么做。
因为你单独设计的上下游引物没问题，单独设计的探针看起来也没问题，但把引物与探针放在一起，就有可能出现参数不兼容的问题。
所以还是三者放在一起设计才好。
探针的设计原则
实时荧光Taqman 探针设计的几个要点实验室很多同学都要做Real time PCR实验,实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见,不过也有实验室前没有做过的,查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物,探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。
目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。
广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针,该探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。
当探针完整的时候,5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭,仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长,因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。
随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)就会将切割探针,释放5′端报告基团游离于反应体系中,远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。
也就是说每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
(请注意,该图显示的不是普通的Taqman探针法,而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。
常用的荧光基团有FAM,TET,VIC,HEX等等。
当探针完整的时候,由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量,本身会发射波长不同的荧光而导致本底高,因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。
定量PCR引物、探针设计原则
精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
引物、探针设计原则浅析
概念
• 引物：一段寡核苷酸序列，其3’端为PCR(polymerase chain reaction）的起点。 分上游（正向）、下游（反向）引物，而扩增产物（扩增子）的长度就是由上下游引 物的位置决定 • 探针：一段经修饰寡核苷酸序列，用来实时监控扩增产物的量。 位于上或下游引物下游，通常紧贴引物。
• 与靶区域互补匹配 • 长度18~25bp • GC含量40%~60% • Tm值通常60±5℃ • 避免连续4个及以上碱基出现，尤其是G四联体 • 避免过多的二级结构，如二聚体、发卡结构 • 3’端严格匹配 • 上下游引物Tm值相差不超过1℃
引物设计原则
探针设计原则
• 与靶区互补匹配 • 确保靶区域高度保守，若保守序列不够长，先设计探针 • 探针长度20~28bp • Tm值比引物通常高10℃，为70℃左右 • 5’避免G碱基，因为其具有淬灭荧光的能力 • 避免4个及以上重复碱基出现 • 避免过多二级结构 • 确保C碱基数多于G碱基数，否者再设计引物 • 探针绝对保守，严格匹配 • 一般而言，引物探针无法完全避免二级结构，可允许二聚体出现，尽量保证ΔG绝对
值小于5 • 引物、探针设计好坏的根本在于序列比对（Sequence Alignment），序列比对成功
引物、探针设计基本完成，使用相应的软件即可 • 软件得出分高的未必就好，分低的未必不好，具体还需从实验结果判定
谢谢观看！
定量PCR 引物、探针设计原则
定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→目的DNA第二步：保持GC）?典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
?探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
探针序列设计最基本的要求
探针序列设计最基本的要求
探针序列设计的最基本要求包括以下几点：
1. 特异性：探针序列应该与目标核酸序列具有高度的特异性结合，以确保准确地检测和识别目标分子。
2. 互补性：探针序列应该与目标核酸序列具有足够的互补性，以便在杂交过程中形成稳定的双链结构。
3. 长度适中：探针序列的长度通常在15-30 个碱基对之间，这样可以确保足够的特异性和结合能力，同时避免过长导致的杂交效率下降。
4. 避免二级结构：探针序列应尽量避免形成自身的二级结构，如发卡结构或茎环结构，以免影响杂交效率和特异性。
5. 碱基组成：探针序列的碱基组成应该均匀分布，避免出现过多的嘌呤或嘧啶碱基，以提高杂交的稳定性和特异性。
6. 熔点温度（Tm）：探针序列的熔点温度应该足够高，以确保在杂交和洗涤过程中保持稳定的双链结构。
Tm 可以通过计算或实验测定。
7. 序列比对：在设计探针序列时，应该对目标核酸序列进行比对和分析，确保探针序列与目标序列的特定区域互补，避免与其他非目标序列发生杂交。
这些是探针序列设计的一些基本要求，具体的设计还需要根据实验目的、检测条件和可用的技术资源进行调整和优化。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
定量PCR 引物、探针设计原则
精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→的DNA保持GC典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
生物探针的概念-概述说明以及解释
生物探针的概念-概述说明以及解释1.引言1.1 概述生物探针是一种用于检测或识别生物分子、细胞或生物过程的工具。
它在生物医学领域具有广泛的应用，能够帮助科研人员了解生物系统的结构和功能，揭示疾病发生的机制，以及进行药物研发和诊断。
生物探针的设计和应用对于生物学、医学、生物技术等领域的发展起着重要作用。
本文将介绍生物探针的定义、应用领域和设计原则，探讨其在未来的发展趋势和意义。
1.2 文章结构本文将首先介绍生物探针的定义，包括其在生物学研究中的作用和意义。
接着，我们将探讨生物探针在不同领域的应用，包括生物医学、生态学和食品安全等方面。
随后，我们将深入讨论生物探针的设计原则，以及在设计过程中需要考虑的因素。
最后，在结论部分，将总结本文的主要内容并展望生物探针未来的发展方向。
通过本文的阐述，读者将能够更深入地了解生物探针的概念及其在科学研究中的重要性。
1.3 目的本文的目的是深入探讨生物探针的概念，明确生物探针在生物学、医学和生物化学领域的重要性和应用价值。
通过对生物探针的定义、应用领域和设计原则进行详细阐述，旨在帮助读者更好地了解生物探针的作用和意义，以及促进生物探针在科学研究和临床诊断中的应用和发展。
同时，通过对生物探针的未来发展进行展望，探讨其在未来可能的创新方向和前景，为相关领域的研究者提供参考和启发。
希望通过本文的撰写，能够为读者提供关于生物探针的全面和深入的了解，促进生物探针技术的进一步发展和应用。
2.正文2.1 生物探针的定义生物探针是一种用于检测生物体内特定分子或生物过程的工具或技术。
它可以是一段DNA、RNA或蛋白质序列，也可以是一种化学分子或荧光标记物。
生物探针通常与荧光显微镜、光谱仪或其他生物分析技术结合使用，用于可视化、定量或分析生物样品中的特定目标物质。
生物探针可以通过与目标物质特异性结合来实现检测，这种特异性通常是通过DNA互补配对、蛋白质配体结合或其他生物分子间相互作用来实现的。
引物探针设计原则
引物探针设计原则引物探针是分子生物学和遗传学研究中广泛应用的工具，它们用于检测给定的DNA序列并在其特定的位置与其结合。
引物探针有许多种类型，但设计它们的原则是大致相同的。
本文将介绍引物探针设计的原则。
1. 引物探针应当特异性。
引物探针的最初设计原则是确保其特异性，即只在目标DNA序列上结合，而不在其他DNA序列上结合。
特异性可通过许多方式实现，如控制探针长度或通过选择引物的位置来避免与其他DNA序列的结合。
特异性也是确保引物探针的准确性和可靠性的关键。
引物探针长度对于其正确结合和探测目标DNA序列至关重要。
长引物比短引物更具特异性，因为它们有更多的机会与目标DNA序列结合。
此外，长引物对于特异性的保持和探测的灵敏度也更好。
3. 引物探针的选择应当优先考虑其3'端。
引物探针的3'端是其结合目标DNA序列的关键区域。
由于DNA聚合酶在扩增反应过程中是从3'端往5'端进行合成的，因此引物探针的3'端需要与目标DNA序列上的互补碱基配对。
在引物设计过程中，选择具有良好稳定性的3'端可以提高反应的特异性和酶活性。
4. 引物探针应当遵循PCR特定的设计规则。
在PCR（聚合酶链式反应）中，引物对于扩增反应的成功非常重要。
因此，在设计PCR 反应时需要考虑许多特定的因素。
例如，引物长度和序列，引物间的距离（扩增产物的大小）以及熔解温度等。
PCR反应的成功与否往往取决于如何正确地设计引物。
5. 引物探针应当特异地结合到目标DNA序列上。
良好的引物探针应当具有明确的探针特异性，在其结合目标DNA序列时表现出特异性。
因此，对于特定实验需要，探针的选择需要进行优化。
方法包括，评估引物和探针的特异性，交叉验证引物和探针与基因组的互补性，并对引物进行最佳的化学修饰和结构设计。
结论引物探针对于许多分子生物学研究非常重要。
在设计引物探针时，需要考虑许多因素，如特异性、长度、优先考虑3'端、PCR特定的设计规则和特异地结合目标DNA序列。
核酸探针设计原则 -回复
核酸探针设计原则
核酸探针设计原则如下：
1.核酸探针应该具有较好的特异性和稳定性，能够准确检测出目标核酸序
列。
2.核酸探针应该具有较高的灵敏度和较低的假阳性率，能够检测出低浓度
的目标核酸序列。
3.核酸探针应该具有较长的寿命和较低的成本，能够进行大规模的检测。
4.核酸探针应该具有适宜的荧光性质，能够进行实时监测和定量分析。
5.核酸探针应该尽可能地减少非特异性杂交和背景信号，提高检测的特异
性。
6.核酸探针应该具有较小的体积和重量，便于集成和自动化检测。
7.核酸探针应该具有较好的操作性和可靠性，能够进行标准化的检测。
总之，核酸探针的设计应该遵循以上原则，才能够实现高灵敏度、高特异性的检测。
探针设计原理
探针设计原理
探针设计原理是指为了实现特定目标，构建一种具备特定功能的仪器或装备，用于获取、监测和记录相关数据以进行科学研究或工程应用的过程。
探针设计原理的重点在于确保探针能够准确地获取所需数据，并保证数据的稳定性和可靠性。
首先，探针的物理特性需要与所要测量的物理量相匹配。
根据被测量的特性和要求，选择合适的传感器或探头。
例如，电阻式传感器适用于测量电阻，温度传感器适用于测量温度等。
同时，还需要考虑探针在被测环境中的适应性和稳定性，如温度、压力、湿度等环境因素对探针性能的影响。
其次，探针的信号获取和处理部分需要设计合理。
探针的信号获取部分通常包括传感器、信号放大器、滤波器等电路组成，用于将物理量转化为电信号并进行放大和过滤。
探针的信号处理部分通常包括模数转换器、数字信号处理器、微处理器等，用于将模拟信号转换为数字信号并进行进一步处理和分析。
最后，探针的工作原理需要考虑数据的获取方式和采样频率。
根据被测量的特性和要求，选择合适的数据采集方式，如时间采样、频域采样等，同时确定合适的采样频率以保证数据的准确性和完整性。
综上所述，探针设计原理涉及到物理特性匹配、信号获取和处理、数据获取方式等方面的考虑，旨在实现准确、稳定和可靠的数据采集。
这些原理的合理应用将为科学研究和工程应用提供可靠的数据基础。
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实时荧光Taqman 探针设计的几个要点
实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、
引物的设计及评价。
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。
目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信
标Molecular Beacon。
广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。
当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。
随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。
也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
报告信号
的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。
常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。
当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。
MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。
同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。
因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。
实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T
的模板可以区分得更为理想。
Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。
另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难
于做质控检测。
Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价
一、实时荧光Taqman探针设计
总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的
片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探
针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计
探针设计的基本原则：
1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2. 探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。
3. 探针的名称:应标记探针在基因组的位置及长度。
4. 探针Tm值计算: 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。
确保探针中GC含量在30-80%。
应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
5. 探针的评价:用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。
选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。
弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。
在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。
弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。
多重荧光PCR 时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。
6. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发
出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
7. Taqman探针与引物之间的位置:Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5’ 端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证
Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。