6-基因组不稳定性

分子机制研究套路（六）

基因组不稳定性

课题：A肿瘤的微卫星不稳定与染色体不稳定研究

1．概念介绍：

微卫星(microsatellite,MS)是由1-6个核普酸组成，具有高度多态性的简单串联重复序列，广泛分布于整个基因组DNA序列中，复制过程中易于发生改变，人类基因组中最常见的微卫星序列是胞嘧啶和腺嘌呤的二聚体（CA），尽管微卫星序列在个体之间存在广泛的多态性，但在个体内部保持一定的稳定性，而且能在后代中保持遗传的稳定，因此微卫星序列是重要的遗传标志，可以作为遗传学研究的标志。微卫星不稳定性(MSI)是这些简单重复序列的改变，MSI只有在许多细胞都发生同样的改变才能被检测出，是肿瘤细胞克隆性增殖的一个指标。错配修复功能下降会引起DNA复制错误增加，导致MSI，目前研究表明MSI是错配修复基因失活的一个重要表型。MSI检测的方法较多，常用的检测方法有变性凝胶电泳、基因扫描、变性高效液相色谱分析等方法。基因扫描法将微卫星位点的PCR引物在一端进行荧光标记，然后扩增该微卫星位点，将PCR扩增产物在荧光毛细管中进行电泳，以基因扫描进行分析得出不同条带的碱基数，从而确定其大小，该方法的敏感性较高，可以高通量检测微卫星位点。

染色体是细胞遗传的物质基础，分子细胞遗传学研究表明大多数肿瘤细胞特别是实体瘤细胞在发生发展的过程中都存在染色体片段的非随机异常，表现为染色体数目或结构的改变，这些改变与原癌基因的扩增和抑癌基因的缺失密切相关。染色体不稳定(CIN)包括整条染色体的获得或缺失(非整倍体)、杂合性缺失、染色体易位、重排、基因扩增导致的染色体均染区、双微体等。

细胞核中DNA含量直接反映细胞核酸代谢水平和生长增殖活性，正常细胞核DNA的含量

比较稳定，多以二倍体形式出现，肿瘤细胞的DNA含量增高，多为非整倍体。测定细胞核DNA的含量可直接反映肿瘤细胞增殖状态，在判断肿瘤的恶性程度及预后方面有重要意义。2．研究思路：

2.1A肿瘤的微卫星不稳定（MSI）研究 (2)

2.1.1A肿瘤中MSI检出率 (2)

2.1.2A肿瘤的MSI与临床病理特征的关系 (3)

2.2A肿瘤的DNA倍体分析 (3)

2.2.1DNA倍体分析结果 (3)

2.2.2A肿瘤的DNA倍体分析与临床病理特征的关系 (3)

2.3比较基因组杂交（CGH）研究A肿瘤的染色体变异 (3)

2.3.1CGH分析结果 (3)

2.3.2染色体变异数与临床病理特征的关系 (3)

2.4染色体变异与DNA倍体的关系 (4)

2.5染色体变异与MSI的关系 (4)

2.1A肿瘤的微卫星不稳定（MSI）研究

2.1.1A肿瘤中MSI检出率

首先需要明确所研究肿瘤类型的微卫星敏感位点MSI-1和MSI-2（例如：单碱基重复序列BA T25和BAT26是检测散发性结直肠癌MSI高度敏感的位点），然后设计引物，并在引物上游或下游标记荧光染料，应用荧光标记多重PCR法扩增微卫星位点MSI-1和MSI-2，应用全自动DNA测序仪和Genescan3.1软件对A肿瘤进行MSI分析。

结果显示：N例A肿瘤患者中，MSI-1和MSI-2两个位点均阳性者＿例，MSI-H发生率为＿%；MSI-L发生率为＿%，其中MSI-1单位点阳性者＿例，MSI-2单位点阳性者＿例；两

个位点均阴性者＿例，MSS发生率为＿%。

2.1.2A肿瘤的MSI与临床病理特征的关系

考察A肿瘤中MSI-H、MSI-L和MSS组别在性别、年龄、组织类型、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移等方面是否有统计学差异。

2.2A肿瘤的DNA倍体分析

2.2.1DNA倍体分析结果

通过流式细胞仪分析＿例A肿瘤标本中，二倍体为＿例，占＿%；异倍体为＿例，

比例为＿%。

2.2.2A肿瘤的DNA倍体分析与临床病理特征的关系

结果显示，A肿瘤的DNA倍体与患者的性别、年龄及组织学类型无明显相关性。低分化癌异倍体发生率高于高、中分化癌，但均未达到统计学差异(P>0.05)。DNA倍体与患者的TNM 分期有密切关系，分期越高，异倍体的比例越高，统计学有显著差异。

2.3比较基因组杂交（CGH）研究A肿瘤的染色体变异

2.3.1CGH分析结果

在CGH检测的＿例A肿瘤中，所有病例均有不同程度的染色体臂发生扩增或丢失。＿例A 肿瘤中共有＿处染色体臂变化，其中＿处扩增和＿处丢失。平均每例变异数为＿，其中扩增数为＿，丢失数为＿，扩增数明显多/少于丢失数，其比例为＿。将＿例A肿瘤出现染色体异常的性质及区域定位总结于一张CGH概貌图，常见的染色体扩增区域(>20%)有:＿，＿，＿等；常见的染色体丢失区域(>20%)有:＿，＿，＿等。

2.3.2染色体变异数与临床病理特征的关系

TNM分期中111、IV期A肿瘤的染色体总变异数和扩增数、缺失数均高于I、

11期，两者差异有统计学意义。肿瘤部位、组织学类型、分化程度等与染色体总

变异数、扩增数和丢失数比较差异均无统计学意义。

常见的染色体扩增区域中＿区域与TNM分期有关，111、IV期A肿瘤＿区域扩增数

明显高于I、11期，＿区域、＿区域和＿区域与TNM分期无明显关系。常见缺失区域＿区域、＿区域和＿区域等与A肿瘤的临床分期间差异均无统计学意义

2.4染色体变异与DNA倍体的关系

＿例二倍体A肿瘤共有＿处染色体臂变化，其中＿处扩增和＿处缺失，平均每例染色体变异数为＿，扩增数为＿，缺失数为＿。＿例异倍体MSS的A肿瘤共有＿处染色体臂变化，其中＿处扩增和＿处缺失，平均每例染色体变异数为＿，扩增数为＿，缺失数为＿。二倍体与异倍体两者在染色体总变异数及缺失数上有显著差异。

二倍体常见的染色体扩增区域(>20%)有:＿，＿，＿等；二倍体常见的染色体丢失区域(>20%)有:＿，＿，＿等。异倍体常见的染色体扩增区域(>20%)有:＿，＿，＿等；异倍体常见的染色体丢失区域(>20%)有:＿，＿，＿等。

2.5染色体变异与MSI的关系

＿例MSI-H的A肿瘤共有＿处染色体臂变化，其中＿处扩增和＿处缺失，平均每例染色体变异数为＿，扩增数为＿，缺失数为＿。＿例MSS的A肿瘤共有＿处染色体臂变化，其中＿处扩增和＿处缺失，平均每例染色体变异数为＿，扩增数为＿，缺失数为＿。MSI-H与MSS两者在染色体总变异数及缺失数上有显著差异。

MSI-H常见的染色体扩增区域(>20%)有:＿，＿，＿等；MSI-H常见的染色体丢失区域(>20%)有:＿，＿，＿等。MSS常见的染色体扩增区域(>20%)有:＿，＿，＿等；MS S常见的染色体丢失区域(>20%)有:＿，＿，＿等。