第九章 实验动物的胚胎工程

酶消化透明带显微玻璃针分割法
酶－机械去带分割法

徒手刀片分割法
（1）显微针分割法
该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操 作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上作一切 口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使 之离散，将其装入2个预先准备好的空透明带内 ，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但 操作程序复杂。
1、不同时期胚胎的体外发育潜能
受精卵和早期胚胎较难培养。
例如，从猪输卵管中收集的受精卵，90%能发育到2
细胞期，但很难超过4细胞期，可是从子宫中收集到
的6-8细胞期胚胎，却有90%的可发育到桑葚胚或囊
胚。 又如，牛受精卵6%可培养到8-12细胞期；2细胞期胚 胎，则有26%可发育到8-12细胞期，8细胞期胚胎则 有51%可发育到桑葚胚。
解冻。 其优点是脱水完全，细胞内不易形成冰，但比较费时 ，冷冻保护剂对胚胎作用时间长。
2、快速冷冻、快速解冻法 是指把胚胎慢速降温到－30――35℃，投入液氮。 两步法、三步法、玻璃化冷冻法等。
解冻可以在30-37℃水浴中进行，20 s。
该方法能较好地克服胚胎脱水少，细胞内冰晶形成 之间的矛盾，获得较高的存活率。解冻后，用蔗糖 洗脱。
第一次获得活至成体的正常小鼠嵌合体。
目前嵌合体动物有小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪和牛 等；种间嵌合体动物有大鼠-小鼠、绵羊-山羊、马斑马、牛-水牛嵌合体；我国有嵌合体动物小鼠、家 兔和山羊。
植入前胚胎嵌合体的制作方法
1、聚合法
第一种：可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致 密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5％链 霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有 5μ g/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个
使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明
治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。 第三种：利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细 胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起 ，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观 察其发育的情况。
2、囊胚注射法
囊胚注射法是把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的 细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经
织培养液、M12培养液、M16培养液等。
培养液组成成分对早期胚胎发育至关重要， 不同动物种类以及不同发育时期的胚胎对培
养液组成成分的要求不同。
发育阻断
阶段性的胚胎培养液
3、一定的气相条件
早期胚胎的培养液需配合一定的气相条件。 一般用含5%CO2的空气或含5%O2和90%N2的混 合气体调节PH值。 胚胎对培养液酸度变化很敏感，PH值超出 7.2-7.4的范围，会引起胚胎死亡。
（三）胚胎培养的应用
1、未成熟卵通过体外培养，使卵子成熟后，进行体外受精。 2、受精卵经培养成为卵裂球后，可以提供胚胎移植或冷冻保存。 3、冷冻胚胎解冻后，经过培养，然后再提供胚胎移植，可以提高 移植成活率。 4、通过胚胎培养实践，不断完善胚胎培养条件，逐步地揭示胚胎 细胞的新陈代谢、发育生长等生命活动中更深刻的奥秘。 5、导入外源基因的受精卵培养到卵裂球后再实施移植，可提高成 功率。
超低温长期冻存胚胎意义
胚胎冷冻技术可以保护珍稀和濒临灭绝的动物, 可以
使利用价值高的品种免于遭受自然灾害、遗传漂变
、传染病等潜在的威胁。 能够使优秀品种品系的种质长期保存下来，并且可
随时复苏、繁殖。
在遗传理论指导下，可改良品种和培育新品种及品 系。 可方便及时地与世界各地交流，推动生命科学蓬勃 发展。
胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作
用，更易聚合。若放到37℃时，效果更佳，聚合完 毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。
第二种：是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵
裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一
个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎 的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用
过程
胚胎分割
（2）显微刀分割法
该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微 操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀一 分为二，分别装入空透明带中，进行移植。
。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻
的化学损伤。
防止冷冻损伤
在冷冻液中，可以加入冷冻保护剂，如DMSO、丙二
醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。
冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产 生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶 液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生， 这种促使溶液结冰的方法称为诱发结晶或植冰（ seeding）。一般，在－3℃ - ―7℃之间诱发结晶 。 现在，人们已经使用玻璃化法冷冻胚胎获得成功 ，在冷冻保存液中加入高浓度的冷冻保护剂，使溶 液粘性增强，当处于超低温时，形成玻璃样液体。
冷冻保存
胚胎冷冻保存是指通过特殊的保护措施和降温程序,
使胚胎在 -196℃条件下停止代谢, 而升温后又恢复
代谢能力的一种技术。 该技术是体外受精、显微注射、转基因和克隆等胚胎 生物技术的重要组成部分。 1971年Whittingham 等首次在超低温条件下成功地冷
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冻保存了小鼠胚胎。其后许多学者对哺乳动物胚胎冷
一、超数排卵
超数排卵（superovulation）：经外源激素处理的雌 性动物，可以改变性周期，可以超常数的排卵，甚至
可以超常数十几倍。
最高排卵量：KM小鼠，83枚/只 兔，88枚/只 金黄地鼠，72枚/只
1、超数排卵方法
通常采用激素进行超数排卵，常用的激素： 促卵泡激素（FSH） 促黄体激素（LH）
第九章 实验动物的 胚胎工程
胚胎工程（embryo engineering ）是指利用 人工方法影响、改变动物胚胎品质发育和进 程的一种生物技术。 基本内容包括：超数排卵、胚胎培养、胚胎 保存、胚胎移植、胚胎分割、性别鉴定、胚 胎嵌合、细胞核移植、体外受精、基因导入 以及胚胎干细胞等。
第一节 实验动物胚胎工程的基本内容
近20多年来，世界上许多实验室均做了大量工作，
发展迅速。
（一）培养方法
微滴培养法和输卵管培养法
微滴培养法是利用塑料平皿制成50μl培养液小滴数 个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平 衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用 注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小
滴。然后将培养皿放到5％CO2、95％空气饱和湿
这在哺乳动物胚胎全体外培养的道路上前进了一大
步。
三、胚胎保存
保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。
非冷冻保存是1948年，由M.C.Chang 等开创的，他们
将兔2细胞胚胎，在同种血清中37℃保存48小时，移
植后产仔。 非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法 、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法
四、胚胎嵌合
胚胎嵌合：又叫胚胎融合，是将两枚或两枚 以上的胚胎(同种或异种动物)的部分或全部
细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然
后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一
种嵌合体后代的技术。
1901年，Spemann最早开始进行动物嵌合体的研究， 他进行了蛙嵌合个体的培育，其目的是为了研究两栖 类动物的发育机制。 1960年，Mintz开始研究嵌合体制作技术，到1965年
冷冻过程中细胞受到的损害
在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害。
快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部
结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。 当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗 到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要 几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中
将细胞推入囊胚腔，使之落到内细胞团之上。操作后的囊胚形
态不规则，经短期培养后，可以恢复正常状态。
制作过程
小鼠嵌合体的制 作过程
胚胎嵌合的意义
应用于发育生物学、免役学和医学动物模型的研究领 域：研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研 究卵裂球分化潜力、分化机制及胚胎细胞基因表达的 机制等； 生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研
孕马血清促性腺激素（PMSG）
人绒毛膜促性腺激素（HCG）
FSH和LH， PMSG和HCG配合使用，效果较好
2、超数排卵的意义
充分利用雌性动物的繁殖潜能。 在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎。
在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产
量，增加经济效益。
二、胚胎培养
胚胎培养就是在体外仿造类似于体内条 件的环境，使胚胎在体外得到与在体内一样
度的37.5℃CO2培养箱中培养所需要的时间。如果 更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控 微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。
输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后， 置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同 种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进
行培养。
（二）从已有的实验结果来看，体外培养有以 下几个关键环节： 体外受精 不同时期胚胎的体外发育潜能 一定的合成培养液 一定的气相条件
所以，在早期胚胎培养时，要牢记“受精卵和早 期胚胎较难培养”的规律，务必要根据所用实验
动物的不同选择特定时期的胚胎，以便成功地启
动动物的胚胎培养。
2、一定的合成培养液
各种动物胚胎对培养液成分要求不同。目 前常用的培养液有BMOC-3液、Whitten液、 Whittingham液、Ham’s液、F10+20%小牛血清 、SOF培养液、PBS+15%小牛血清、TCM-199组
冻保存进行了大量的研究。
超低温冷冻保存方法
1、慢速冷冻、慢速解冻法是最早建立起来的哺乳动物 胚胎冷冻方法。 室温开始以1℃/分钟的速度降低到－7℃，平衡5分钟 ，诱发结晶，平衡5~10分钟，再以0.1~0.3℃ /分钟的 速度降到－80℃以下，投入液氮长期保存。
解冻时，须慢速升温，以每分钟上升8℃的速度进行
的正常发育，这是胚胎工程研究与应用中非
常重要的步骤。
早在1913年Brachet就尝试对兔囊胚进行体外培养
实验，可是由于对各种动物胚胎所需的体外培养液 配方不清楚，致使这方面的工作在20世纪上半世纪 发展缓慢。 1957年，美国学者Whitten找到了能使小鼠早期胚 胎在体外生长发育的培养液配方，从而为哺乳动物 体外胚胎培养打开了一条通路。
注意
进行体外培养的哺乳动物胚胎，一般只是着 床前的早期胚胎。 胚胎着床后，同母体建立了密切的物质交换 关系，对营养条件的需求更加复杂，因此对 着床后时期的胚胎体外培养更加困难。
自从开展体外培养胚胎技术研究以来，最为成功的
有大鼠、小鼠和兔的胚胎培养。 小鼠胚胎培养时间最长的是Y.O.Hsu和L.T.Chen（ 1983）把受精后3.5天的鼠胚培养到相当于在子宫内 正常发育的第10天胚胎。胚胎发育经过了原肠胚、 神经胚、体节期等阶段，培养到第10天时发育出了 肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。
究分析；分析胎儿和母体的相互关系。
胚胎嵌合的意义
畜牧业生产中的应用：培育杂种个体，甚至是种间杂 种；通过制作各种组合的嵌合体，培育具有特殊皮毛 特性的新品种，提高毛皮的经济价值。 培育含有人类细胞的动物，为人类器官异种移植提供 材料来源。
五、胚胎分割
同卵双生
五、胚胎分割
概念：胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚
分化的细胞。若注入的细胞并入内细胞团并参与胚体的形成，
那么就形成了嵌合体。 注射时，选取健康、生长良好的细胞。如果是培养细胞，应该 保证其整二倍体性。将10－12个细胞吸入到注射吸管的顶端。 用固定吸管吸住内细胞团与滋胚层交界处，让内细胞团位于囊 胚的底部位置。调整注射吸管与固定吸管使处于同一焦点平面 ，选择滋胚层细胞间的“间隙处”，将注射吸管插入囊胚腔。
胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，
经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵 双生或同卵多生后代的技术。
意义：胚胎分割技术不仅可以使胚胎移植的胚胎数目
成倍增加，而且可以产生遗传性状相同的后代，因此
是一种广义上的克隆技术。
胚胎分割方法
显微玻璃针去带分割法
显微手术直接分割法