crisper-cas 基因靶向技术

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crisper技术的原理及应用

Crispr技术的原理及应用一、Crhsp技术的原理Crispr，全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”，即“聚集规律间隔的短回文重复序列”。

Crispr技术是一种基因编辑技术，能够准确、高效地修改生物的基因组。

它是通过利用细菌及其他单细胞生物天然具备的防御机制而发展起来的。

Crispr技术主要基于Crispr-Cas系统进行操作。

Crispr-Cas系统是一种免疫系统，可以识别并摧毁入侵的病毒或外源基因。

它由Crispr序列和Cas蛋白组成。

Crispr序列由一系列回文重复序列和插入序列组成，插入序列是外源DNA或RNA片段的一部分。

而Cas蛋白则是实施基因编辑的关键。

Crispr技术主要通过以下步骤实现基因编辑：1.选择适当的Crispr序列和Cas蛋白：根据目标基因组进行筛选并选择具有高编辑效率的Crispr序列和Cas蛋白。

2.构建Crispr载体：将Crispr序列和Cas蛋白编码序列插入适当的载体中，以便在细胞中进行表达。

3.递送Crispr-Cas系统进入目标细胞：通过转染或病毒载体等方式将Crispr-Cas系统导入目标细胞。

4.Cas蛋白介导的DNA切割：Crispr-Cas系统识别目标基因组的特定位置，并通过Cas蛋白的核酸切割活性切割目标DNA。

5.修复DNA：细胞会尝试利用自身的DNA修复机制修复Cas蛋白切割后的DNA断裂。

6.基因编辑效果评估：通过PCR、测序等方法对编辑后的基因进行验证和分析。

二、Crispr技术的应用Crispr技术的发展将基因编辑带入了一个全新的时代，它已被广泛应用于以下领域：1. 遗传治疗Crispr技术可以用于修复和纠正遗传病的基因突变。

通过切除或替换有缺陷的基因序列，可以纠正导致遗传病的突变，并恢复正常的基因功能。

2. 农业领域Crispr技术可以用于改良作物和畜禽的基因组。

CRISPR-Cas 9

CRISPR-Cas系统的发现
1 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。 2 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列
（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细
再见
Cas 9

TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。 Cas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH 核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡ CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9 完成前体 crRNA 的成熟。随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成 RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA 功能[36]．
菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。
CRISPR-Cas概述
CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术
CRISPR-Cas概述

应用

基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。[2] 2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。[2] CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔

CRISPRCas技术最新进展保持DNA完整而又激活靶基因(原理图清晰)

CRISPRCas技术最新进展保持DNA完整而又激活靶基因（原理图清晰）/article_detail_103_2_41427.html#tt_d aymode=1&tt_font=l （原理图清晰）作者语辰基因编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术CRISPR/Cas系统因其操作简便、能高效精准的在特定位点对DNA进行切割和编辑，近年来一直是生物技术领域的研究热点。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗病毒和外源DNA的入侵。

其中Cas (CRISPR associated protein)是一种核酸内切酶，在含有与靶标DNA互补序列的向导RNA的指引下识别DNA的特定位点并进行切割，形成双链DNA缺口，随后细胞借助同源重组或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复，从而形成DNA插入或移除的突变，实现基因编辑。

RNA介导的CRISPR/Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图虽然基于CRISPR的基因编辑系统，在许多人类疾病的小鼠模型中显示了极大的治疗潜力，但Cas9在诱导DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)的过程中可能脱靶，引入未知的突变，对病人造成伤害，限制了其临床应用。

改进的CRISPR/Cas9技术《Nature Reviews Genetics》高级编辑Darren J. Burgess 近期撰文“Translationa l genetics: CRISPR therapies - making the grade not the cut”，点评了美国Salk生物研究所Juan Carlos IzpisuaBelmonte课题组研究人员利用改进的CRISPR/Cas9技术介导转录-表观遗传调控，在小鼠体内激活多个靶基因的工作。

Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组改进的CRISPR/Cas9系统图示利用CRISPR系统对转录进行调控，通常需要将不具有核酸酶剪切功能的Cas9 (dCas9)与能调节转录的蛋白区域进行融合，该蛋白区域可以是转录激活因子、转录抑制因子或是组蛋白修饰酶。

CRISPR-Cas13d系统：一种靶向RNA的基因编辑技术

CRISPR/Cas13d系统：一种靶向RNA的基因编辑技术•引言：CRISPR/Cas系统是一种由细菌和古菌进化出来的一种自我防御机制，能够利用特殊的核酸酶（Cas蛋白）和向导RNA（gRNA）对外源DNA进行识别和切割，从而实现基因编辑的功能。

CRISPR/Cas系统根据Cas蛋白的不同可以分为不同的类型和亚型，其中，最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，而CRISPR/Cas13d是目前最新的VI-D 类靶向RNA的CRISPR/Cas系统。

Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a/b/c 相比蛋白更小，这种尺寸使其更容易包装到容量较小腺相关病毒（AAV）载体中。

通过设计sgRNA（short guide RNA)，以引导CasRX（Cas13d 的一种）蛋白在对RNA的定点切割，造成RNA的降解，达到抑制基因表达的目的。

由于CRISPR/Cas13d系统不借助细胞体内的RISC(RNA 介导的沉默复合物，shRNA干扰的核心结构)，使其不仅能高效干扰细胞质RNA，而且能高效的干扰核内RNA（lncRNA等），补充了shRNA 在核内RNA干扰上的不足。

•CRISPR/Cas13d系统的工作原理：CRISPR/Cas13d系统是由Cas13d蛋白和sgRNA组成的复合物，其中Cas13d蛋白是一种能够切割单链RNA （ssRNA）的核酸酶，而sgRNA是一种能够与Cas13d蛋白结合并指导其识别目标RNA的短片段RNA。

Cas13d蛋白由四个功能域组成，分别是N端结合域（NBD）、核酸识别域（NRD）、催化域1（CTD1）和催化域2（CTD2）。

其中，NBD负责与sgRNA结合，NRD负责与sgRNA互补配对的目标RNA结合，CTD1负责切割目标RNA上与sgRNA互补配对区域附近的位置，CTD2负责切割目标RNA上与sgRNA互补配对区域无关的位置。

当Cas13d/sgRNA复合物与目标RNA结合后，Cas13d蛋白会被激活，并开始切割目标RNA以及周围的非特异性ssRNA，从而造成大量的RNA降解和基因沉默。

简述crisper的技术原理与应用

简述crisper的技术原理与应用什么是crisper？CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种新型的基因编辑技术，被广泛应用于生物学和医学研究领域。

CRISPR技术利用CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白和CRISPR RNA来定向修改生物体的基因组序列，具有高效、精准和简单操作的特点。

CRISPR的技术原理CRISPR技术的核心原理包括CRISPR RNA的导向和Cas蛋白的剪切。

1. CRISPR RNA的导向CRISPR RNA是由一小段常规RNA（tracrRNA）和一小段可变RNA（crRNA）通过互补配对而组成的。

crRNA中含有与目标基因组序列互补的序列，可以精准地识别和定位到目标基因组的特定位置。

2. Cas蛋白的剪切Cas蛋白是CRISPR-Cas系统中的核心组分，具有核酸酶活性。

Cas蛋白能够与crRNA形成复合物，并识别与crRNA互补的目标基因组序列。

一旦Cas蛋白与目标基因组序列结合，其核酸酶活性将介导目标基因组序列的切割。

CRISPR的应用CRISPR技术在基因编辑、疾病治疗和农业改良等领域有着广泛的应用前景。

1. 基因编辑CRISPR技术可以精确地修改生物体的基因组序列。

通过设计特定的crRNA和引入Cas蛋白，可以实现对目标基因组的精准编辑，如基因敲除、基因插入、基因修饰等。

这种精准编辑的能力为基因功能研究和疾病治疗提供了有效的工具。

2. 疾病治疗CRISPR技术被广泛应用于治疗遗传性疾病。

通过CRISPR技术可以修复或替换患者体内的异常基因，恢复正常的基因功能。

这为一些无法通过传统治疗手段治愈的疾病提供了新的治疗思路，如遗传性疾病、癌症等。

3. 农业改良CRISPR技术也被用于农业领域的基因改良。

通过定向编辑植物的基因组，可以增加植物的耐逆性、抗病虫害能力和产量。

植物多靶点CRISPR-Cas9载体使用方法(2015-5-1)

CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting ofgenomic sites in monocot and dicot plants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组(**************.cn )1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。

CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA 引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs ），TALENs 更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。

我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。

本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA 表达盒的多克隆位点Bsa I 位于靠近双元载体RB 位置。

sgRNA 表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR 方法拼装好，再利用Golden Gate 或Gibson Assembly 克隆方法组装到双元载体上。

本载体系统已经发表（Ma et al., 2015, Molecular Plant , DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。

5’ NNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Target SitePAM NNNNNNNNNNNN-3’3’ NNNNNNNNNNNN NCCNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5’-G/A NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGAGCUAG A A CGAUA GAAAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU Cas9nuclease Cleavage site genomesequenceRuvC-like domain HNH domain CUUGAAAAAGUGGCACCGA G CGUGGCU UUUUU-3’NGGFigure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱2.1CRISPR/Cas9双元载体本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征(Figure 2)。

cas9 功能基因筛选

cas9 功能基因筛选
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，它可以用于基因筛选以及其他基因编辑应用。

在基因筛选方面，CRISPR-Cas9可以通过靶向特定基因的DNA序列，来实现对该基因的编辑或沉默，从而揭示该基因在细胞或生物体中的功能。

以下是CRISPR-Cas9在功能基因筛选中的一些重要方面：
1. 靶向性，CRISPR-Cas9系统可以被设计用来精确地靶向特定基因的DNA序列，使得研究人员能够选择性地编辑或沉默感兴趣的基因。

2. 高效性，相较于传统的基因筛选技术，CRISPR-Cas9具有更高的编辑效率，可以更快速地实现基因编辑和筛选。

3. 多功能性，CRISPR-Cas9不仅可以用于基因沉默，还可以实现基因敲入、基因突变等多种基因编辑操作，使得研究人员能够更全面地了解基因的功能。

4. 高通量筛选，结合高通量测序技术，CRISPR-Cas9可以实现对大规模基因组的筛选，从而加快对基因功能的理解。

5. 生物医学应用，CRISPR-Cas9的功能基因筛选在疾病研究和
药物开发中具有重要意义，可以帮助科学家们发现与疾病相关的基因，以及潜在的治疗靶点。

总之，CRISPR-Cas9在功能基因筛选中具有高度的灵活性和精
准性，为研究人员提供了强大的工具来探究基因的功能和作用机制。

这些特点使得CRISPR-Cas9成为当前基因筛选和编辑领域的热门技
术之一。

CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入

1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列
R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。
CRISPR-Cas9大PR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配对
利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的 CRISPR－on系统。

CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPRCas9的应用及脱靶效应研究进展一、本文概述CRISPR-Cas9是一种基于细菌防御机制的基因编辑技术，自其问世以来，已经在生物学、医学等多个领域产生了深远的影响。

本文旨在全面概述CRISPR-Cas9技术的应用现状以及脱靶效应的研究进展。

我们将首先介绍CRISPR-Cas9技术的基本原理及其在基因编辑、疾病治疗、农业生物技术等领域的广泛应用。

随后，我们将重点关注CRISPR-Cas9技术中的脱靶效应问题，探讨其产生机制、影响因素以及目前的检测与防控策略。

通过综述最新的研究成果，我们希望为相关领域的研究者提供有价值的参考，推动CRISPR-Cas9技术的安全、高效应用。

二、CRISPR-Cas9的应用CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已经在众多领域展现了广阔的应用前景。

自从其问世以来，科学家们已经在基因组编辑、基因功能研究、疾病治疗、农业生物技术以及药物开发等多个领域取得了令人瞩目的成果。

在基因组编辑方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种精确、高效且相对简单的手段来修改生物体的基因组。

通过设计特定的sgRNA，研究人员可以精确地定位到目标DNA序列，并利用Cas9蛋白的切割活性在特定位置造成双链断裂。

随后，细胞内的DNA修复机制将介入修复这些断裂，从而导致目标基因的突变或删除。

这种技术已经被广泛应用于各种生物体，包括人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、植物等。

在基因功能研究方面，CRISPR-Cas9系统提供了一种高通量的方法来研究基因的功能。

通过构建基因敲除或敲入的细胞系或动物模型，研究人员可以系统地研究特定基因在生物体发育、生理和疾病过程中的作用。

CRISPR-Cas9还可以用于研究基因间的相互作用以及基因调控网络。

在疾病治疗方面，CRISPR-Cas9系统为遗传性疾病的治疗提供了新的希望。

通过纠正致病基因中的突变或删除致病基因，CRISPR-Cas9有可能根治许多遗传性疾病，如囊性纤维化、镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良症等。

p选择素靶向原理

p选择素靶向原理选择素靶向原理（CRISPR-Cas9）是一项革命性的基因编辑技术，它可以通过精确地修改基因组来创造或修饰生物体的性状。

这一技术的出现引起了全球范围内的关注和研究热潮，并为医学、农业、生物学等领域带来了巨大的创新和发展。

选择素靶向原理的核心是利用细菌天然的免疫系统——CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），结合Cas9蛋白，实现精确的基因编辑。

CRISPR是一种原始的RNA辨识系统，在细菌中发现，并已广泛研究的基因组中。

为了解释CRISPR的工作原理，我们首先需要了解Cas9是什么。

Cas9是CRISPR相关蛋白9的简称，是CRISPR系统中最重要和最具特异性的核酸酶。

Cas9酶能够精确识别并切割DNA，将其分离成两个单链。

与此同时，CRISPR系统还包含与Cas9一起工作的引导RNA （gRNA）。

gRNA是一种特异性基因序列，能够与目标DNA的特定序列配对。

当gRNA与Cas9结合并确定目标DNA位置后，Cas9酶会剪断DNA链，从而导致DNA损伤。

选择素靶向原理的工作流程如下：首先，在实验室中合成和设计合适的gRNA，以使其与目标基因的特定序列匹配。

然后，将Cas9酶与gRNA结合，形成复合物。

此复合物将在接下来的步骤中用于编辑DNA。

接下来，将复合物直接导入目标细胞中。

Cas9酶将通过它所识别的序列将gRNA引导到目标基因的特定位置，并剪裁DNA链。

这样，基因组中的一个或多个碱基将被切割，导致该基因发生修饰。

一旦DNA链被切断，细胞会利用自身的修复机制进行修复。

细胞主要有两种修复路径：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）。

NHEJ是细胞常用的修复方式，它将断裂的DNA链连接在一起，但常常引入不完全的突变。

HDR是另一种方式，其中损坏的DNA链与具有相同序列的模板DNA链进行匹配和交换。

crispr cas9技术

• 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer) 与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类
1.2 .CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/cas9基因编辑技术及应用
——— 一种来源于细菌获得性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶向基因获得性修饰的技术
1. CRISPR-Cas系统简介
• 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)
在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与
野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使
用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可
以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行
操 Ca作s9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立 k1n、oc设k-计ou识t细别靶胞位系点）的一对DNA Oligos
CRISPR/技术的前景及优缺点
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换 20个核苷酸就行。

crispercas9是什么

crispercas9是什么CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。

2017年3月，英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果，利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠。

一、研制经过盖茨投资了生物医药公司EditasMedicine，这家公司开发出了一种名为CRISPR-Cas9的基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病，不过尚未进入人体试验阶段。

2016年7月21日，世界上最有名望的科学杂志之一《自然》杂志官网发出重磅消息：2016年8月，中国科学家有望开展全球首个CRISPR-Cas9基因编辑临床试验，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除基因再回输入患者体内用以治疗肺癌，试验将由四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授及其研究小组进行，这一临床试验已于2016年7月6日通过了医院审查委员会的伦理审批。

T淋巴细胞本身应是人体内抗肿瘤的“斗士”，但因各种原因，导致免疫耐受，不能有效地杀伤肿瘤细胞。

卢铀团队即将进行的临床试验，就是将受试者体内的免疫T细胞分离出来，利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑，选择性地敲除细胞基因中一种编码PD-1蛋白的基因，从而将T细胞潜在的对肿瘤细胞的攻击能力“激活”。

在体外进行T细胞培养扩增后，再输回患者体内，用T细胞去攻击肿瘤细胞，达到预期的治疗目的。

2017年3月，英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果，一种基因组编辑方法能够阻止小鼠视网膜退化，利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠。

该方法可适用于导致色素性视网膜炎（失明的主要原因）的各种潜在遗传缺陷。

色素性视网膜炎无法医治、不易觉察，对患者眼睛造成极大危害而且具有遗传性。

该病特征就是视网膜退化，但由于色素性视网膜炎可能由60多种基因的突变引起，因此，想要制定针对性疗法来修复每一个具体的基因是非常困难的。

crisper-cas-基因靶向技术教学教材

• 其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。
• 在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。
• Cas9含有RuvC和HNH2个独特的活性位点，在crRNA 成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Transactivating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发 Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA 双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。
• 目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。
• Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。
CRISPR的工作原理
• 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的 RNA前体(Pre RISPR RNA，precrRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
CRISPR担当细菌的防护罩
• CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区 (Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。

crispercas9基因编辑原理

crispercas9基因编辑原理
CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种利用RNA-Cas9蛋白复合物进行特定基因的精确编辑的技术。

CRISPR-Cas9是一种轻松无痛的基因修饰技术。

它可以有效地定向编辑、插入或
删除特定基因，以修复基因突变以治疗多种遗传性疾病。

CRISPR-Cas9技术来源于天然防御机制，是由一种被称为CRISPR-Cas9的蛋白复合物
组成的，由一条RNA夹带着伴侣蛋白Cas9和一种叫做tracrRNA的RNA组成。

RNA是一种
单链核酸，Cas9是一种酶，能够在DNA双链中定位、切开并结合某些RNA片段。

CRISPR-Cas9蛋白复合物是一种复杂的分子结构，它具有定位、辨别及酶切的功能。

研究人员可以将CRISPR-Cas9的某些部分改造，以使其能识别目标基因，并将人工构建的DNA片段插入
目标位置以覆盖原始突变。

CRISPR-Cas9技术的运作原理很简单，通常情况下它以一种叫做“现场DNA剪切”的
方式运作。

首先，RNA复合物会识别特定基因的序列，然后Cas9蛋白切开 DNA双螺旋，
最后，人工构建的DNA片段插入目标位置，并将原始突变覆盖掉。

由于设计原理的简单性，CRISPR-Cas9技术的应用极为广泛，如人类基因编辑、植物基因编辑等等都可以使用它。

CRISPR-Cas9技术的优势在于可以快速有效地编辑基因，而且相较于传统基因编辑技
术而言，这种新型技术能够快速精准地编辑指定基因序列。

另外，这一技术也可更加节省
时间和资源，因此，CRISPR-Cas9的出现是一个突破，将加速基因工程及治疗遗传性疾病
的进程，改变着人类进化的历史。

crisper cas9技术简介

pAAV-miCMV-Cas9
6.2kb
pAAV-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H422 H423
说明腺相关病毒, Cas9 腺相关病毒,表达gRNA
Thanks!
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联系方式: 杨兴林, yxl@
Cas9位点查找
Cas9位点查找
选择最优的cas9靶点
Cas9载体构建
Cas9载体活性验证
Cel1实验原理示意图
Control
Cas9
PCR产物~500bp 预测切割产物~340bp
预测切割产物~160bp
Cas9质粒活性检测实例
和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
和元Cas9载体系统
11.9kb pLenti-CMV-Puro-T2A-3Flag-Cas9n
7.9kb
pLenti-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H136 H137 H140
说明 Puro抗性标记 Cas9n, Puro抗性标记慢病毒, gRNA载体
基于腺相关病毒载体的Cas9系统
载体大小
载体全名
7.4kb
基因组编辑技术 -CRISPR/Cas9
杨兴林博士
主要内容
1. CRISPR/Cas9技术的基本原理 2. CRISPR/Cas9主Байду номын сангаас实验流程 3. 和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
CRISPR/Cas9技术的基本原理
基因组编辑技术
一种利用同源重组 (Homologous Recombination,HR) 或者非同源末端连接(Non-homologous End Joining, NHEJ) 原理改变生物体内源基因的遗传学技术。

crispercas9基因编辑原理

crispercas9基因编辑原理
CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种基于RNA-蛋白质复合物的精准基因编辑技术，可以改变某一特定遗传物质的形状，从而产生新的基因表达。

CRISPR/Cas9是一种可以实现精准基因编辑的有效工具，它可以被用来修改基因的突变，改变基因的表达，插入新的基因，以及删除不需要的基因等。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是基于一种叫做CRISPR的自然现象，它能够识别并切割特定的DNA序列。

这一技术的基本原理是利用一种叫做CRISPR-Cas9的RNA-蛋白质复合物，它能够精确地结合到特定的DNA序列，然后将DNA切割成两段。

随后，破裂的DNA段会被新的DNA段所替换，从而达到基因编辑的目的。

由于CRISPR/Cas9基因编辑技术的精确性高且成本低，它已经成为生物技术领域里最流行的研究工具之一。

在近几年，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被用于各种生物学研究，包括药物发现、疾病的诊断和治疗以及农业的育种等，取得了令人惊叹的成果。

此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术也被用于临床试验，以研究疾病的病理机制以及治疗方法，从而为病人提供更好的治疗方案。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种先进的生物技术，具有精确性高、成本低和操作简单等特点。

它已经被广泛应用于生物学研究，也可以用于治疗疾病。

因此，CRISPR/Cas9基因编辑技术有望在未来发
挥更大的作用，为人们的健康带来福音。