TALEN和CRISPER基因靶向技术
基因打靶技术
目标序列特异性 列，且识别序列常受 何序列，且特异
上下游序列影响
性高
细胞毒性
较高
低
脱靶情况
11%
1%
实验周期 长，（Sigma8个月)
短
实验费用
高
低
实验成功率
～10%
高
机制： 1，外源DNA整合到宿主5’端两个重复序列之间，
成为新的间隔序列 2，转录和加工前体的 靶向性切割 外源DNA序列
crRNA由宿主基因组转录出来，那如何避免降解自身序 列的？
1，外源DNA的原 间隔序列旁 有 PAM（NGG）， 而宿主没有 2，成熟的crRNA 还包含有部分重复 序列，可与宿主基 因组配对，而外源 DNA不能
应用时，只需转染能表达Cas蛋白和gRNA的质粒
CRISPR-Cas9
CPISPR/Cas系统优缺点
入DNA片段，染色体倒转和异位。破坏基因功能
Homology directed repair: 同源重组修复 需要donor Homologous
template 可插入某基因或通过点突变修
改某个基因
TALEN=TALE+ FokI
TALE是黄单胞杆菌的一类分泌蛋白，能够与寄主靶基因的 启动子DNA序列进行特异性识别和结合，从而调控寄主的 基因表达。
TALE由N端的转运信号、C端的核定位信号、中间的 DNA结合域—一组氨基酸重复单元串联而成，每个重复单 元有34个aa,其中第12、13有多态性，识别并结合一个核 苷酸
287AA
295AA
TALE 对核苷酸的特异性
一个氨基酸序列模块 识别一个碱基，简单且特异性好。通过组 合各类模块，可对任何核苷酸序列进行靶向性特异性敲除
植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因编辑分类
基因编辑分类基因编辑是一种现代生物技术，通过人为修改生物体的基因组来实现对特定基因的精确编辑和修饰。
基因编辑技术的出现，为科学家提供了一种有效的手段来研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物等。
基因编辑可以分为不同的分类，主要包括以下几种技术：锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子（TALEN）、CRISPR/Cas9等。
这些技术都具有各自的特点和优势，但基本原理相似，都是通过靶向性切割或改变基因组中的DNA序列，从而实现对特定基因的编辑。
锌指核酸酶是一种最早被应用于基因编辑的技术。
它利用锌指蛋白与DNA序列特异性结合的特性，将特定的锌指蛋白与DNA切割酶结合，实现对目标基因的编辑。
然而，锌指核酸酶技术具有设计复杂、成本高昂等缺点，因此在实际应用中受到一定限制。
转录活化因子是一种基于转录因子结合DNA序列的基因编辑技术。
它通过设计合成的转录活化因子来激活或抑制特定基因的表达。
转录活化因子技术相对于锌指核酸酶技术来说，具有更高的特异性和选择性，可以实现对基因表达的精确调控。
CRISPR/Cas9技术是目前最为广泛应用的基因编辑技术之一。
它利用CRISPR序列与Cas9蛋白的结合，形成一种RNA-DNA复合物，通过与目标DNA序列互补配对，实现对特定基因的精确编辑。
相比于其他技术，CRISPR/Cas9技术具有设计简单、操作方便、高效率等优势，已经被广泛应用于基因研究、基因治疗等领域。
除了这些主要的基因编辑技术外，还有一些其他的技术正在不断发展和完善，如CRISPR-Cpf1、Prime Editing等。
这些技术的出现，进一步丰富和完善了基因编辑技术的工具箱，为科学家们在基因研究和应用方面提供了更多的选择和可能性。
基因编辑的应用领域非常广泛。
在基础科学研究中，基因编辑可以帮助科学家们揭示基因功能和调控机制，深入了解生物体的发育、生长和繁殖过程。
在医学领域，基因编辑可以用于治疗遗传疾病，如肌萎缩侧索硬化症、血友病等。
基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN
基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。
大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。
区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。
在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。
首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到小鼠囊胚。
接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是更多孕育、更多筛选，一直下去。
复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。
它几乎只对小鼠起作用。
原因还不是很清楚，也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。
大鼠和人类则不是这样。
不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。
大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。
区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。
锌指核酸酶（ZFN）第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略就是锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFN）。
锌指蛋白是转录因子；每个指模块识别3-4个碱基的序列，将这些模块混合搭配，研究人员或多或少能靶定他们希望的任何序列。
Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推出CompoZr ZFN试剂平台。
ZFN是异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个FokI核酸内切酶结构域。
FokI结构域必须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的DNA结合事件才能实现双链断裂，从而增加了目标特异性。
切割事件使得大部分基因组编辑技术得以实现。
在双链断裂后，细胞试图修复它。
最简单的方法是非同源末端接合（NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，这往往产生移码。
基因编辑的类型及应用
基因编辑的类型及应用基因编辑是指通过利用生物学技术，对生物体的某个基因进行精确地改变，从而达到对生物体进行遗传性质调控的目的。
基因编辑主要包括以下四种类型：CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN和RNAi。
1. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是现代基因编辑技术中最流行的一种，其原理是利用一种CRISPR 序列破坏基因，通过语义识别获得对准的目的基因序列后，再利用Cas蛋白进行切割。
CRISPR/Cas9技术的优点是操作简单、效率高、成本低，应用范围广泛，已被广泛应用于植物、动物和人类基因编辑。
2. ZFNZFN全称锌指核酸酶，是锌指蛋白质和核酸酶的复合体，能够精确地切割目标基因序列。
ZFN技术的优点是精确性高、可以编辑大分子，但缺点是操作复杂且成本高。
3. TALENTALEN是转录激活样效应器核酸，它包含了转录的核酸结构域和核酸酶切割结构域，可以在其特定的核酸序列靶点上精确切割得同时引发目的基因的编辑。
TALEN技术和ZFN技术类似，具有精确性高、成本高、操作复杂等特点。
4. RNAiRNA干扰技术是利用人工合成的RNA分子，靶向性分解特定基因mRNA的过程，从而阻断该基因的表达。
RNAi适用于短期基因的研究，可以用于从细胞水平探究特定的基因的功能及基因调控。
基因编辑的应用：1.农业生产领域：基因编辑可用于转化作物抗病能力，以提高作物生长和产量，避免作物被病毒、虫害侵袭。
2.医学领域：基因编辑可用于治疗一些遗传性疾病，例如囊性纤维化、遗传性失聪和血友病等疾病。
3.生殖医学：基因编辑技术可以进行人工胚胎修饰，以确保健康基因与优良的基因筛选，避免某些基因突变的传递。
4.基础研究：基因编辑技术可用于基因功能的研究，筛选功能未知的基因，并阐明其生物学功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。
总之，基因编辑是注意革同时期的新型技术，具有广泛的潜在应用，但其技术风险需得到高度关注。
生物学基因编辑技术的原理与应用
生物学基因编辑技术的原理与应用基因编辑技术是近年来生物学领域的一项突破性技术，它被广泛应用于基因研究、治疗疾病和优化生物种质等方面。
本文将介绍生物学基因编辑技术的原理和主要应用。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要通过特定的酶系统改变生物体的基因序列，以实现精确的基因组操作。
目前最常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）、转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）、CRISPR/Cas9等。
1. 锌指核酸酶（ZFN）锌指核酸酶是一种DNA结合蛋白，由锌指结构域和核酸酶结构域组成。
通过引入特定的锌指蛋白，可以使其与DNA靶标特异性结合，并切割DNA分子，从而实现基因组编辑。
2. 转录活化因子样效应核酸酶（TALEN）TALEN是一种由转录活化因子结构域和核酸酶结构域组成的人工构建蛋白。
它可以与目标DNA特异性结合，并在目标位点引发DNA双链断裂，从而与细胞内自我修复机制相互作用，实现基因组编辑。
3. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前最为流行的基因编辑技术，它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）引导Cas9核酸酶特异性结合到目标基因组中，形成DNA双链断裂，再通过DNA修复机制改变基因组序列。
二、基因编辑技术的应用1. 研究基因功能基因编辑技术可以用于研究基因的功能和作用机制。
通过特定的编辑技术，可以删除、插入或修饰目标基因，以观察其对生物体生理、发育和疾病等方面的影响，为研究基因的功能和相关疾病的发生机制提供重要依据。
2. 治疗基因疾病基因编辑技术被广泛应用于治疗基因疾病。
通过修复或替代异常基因，可以纠正遗传性疾病的发生。
例如，利用基因编辑技术可以修复人类干细胞中的异常基因，然后将其转化为正常的组织细胞用于治疗疾病。
3. 农作物改良基因编辑技术在农业领域有着广阔的应用前景。
通过编辑植物基因组，可以提高植物的农产品产量、质量和抗病能力，实现农作物的优化和改良。
CRISPR与Talen基因组编辑技术对比分析
CRISPR与Talen基因组编辑技术对比分析基因组编辑技术一直是生物学和医学领域的研究热点。
近年来，CRISPR和Talen成为最受关注的两种基因组编辑工具。
本文将对CRISPR和Talen进行对比分析，从技术原理、效率、精确性、应用范围等方面综合评价它们在基因组编辑中的优缺点。
首先，我们来探讨这两种技术的原理。
CRISPR（聚合酶鏈反應辅助人工制造的双链RNA）技术利用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑，其中Cas9是一种核酸内切酶，能够识别特定DNA序列并实现DNA切割。
CRISPR系统通过引导RNA（gRNA）与Cas9结合，使其精确识别目标DNA序列，从而实现靶向编辑。
与之相比，Talen（转录激活样基因分子）技术使用转录激活样基因分子（TAL）蛋白质和DNA结合结构域构建。
Tal蛋白质通过与DNA靶位点结合，识别与目标DNA序列互补的核酸，并通过特定核酸串联域（repeats）和变异核酸接头（TAL effectorDNA-binding domain）实现DNA的编辑。
Talen的特点是能够精确定位到任意DNA序列，并且可以进行多点编辑，但其设计和构建过程较为复杂。
在效率方面，CRISPR技术相对于Talen具有更高的编辑效率。
由于CRISPR-Cas9系统利用了高度特异的RNA-DNA序列互补配对，因此能够更容易地找到并切割目标DNA序列。
相比之下，Talen需要通过设计和构建Tal蛋白质与特定DNA序列结合，这一过程较为繁琐。
因此，CRISPR在实现基因组编辑时具有更高的效率和灵活性。
精确性是基因组编辑技术的关键指标之一。
在这方面，CRISPR技术存在一定的局限性。
由于CRISPR-Cas9系统一般通过非同义突变来引导编辑，存在一定的脱靶效应，可能导致编辑到非目标位点的DNA序列。
虽然研究人员已经通过改进gRNA设计和Cas9蛋白质的改造来减少脱靶问题，但在实际应用中仍存在一定的风险。
各种基因编辑技术比较及其优缺点分析
各种基因编辑技术比较及其优缺点分析基因编辑技术是近年来备受瞩目的一项技术。
它可以通过人工改变某些基因的结构，以达到预定的目的。
目前已经涌现出许多围绕基因编辑技术的研究成果，其中最为著名的几种基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等。
那么，这些技术各有什么优缺点呢？下面我们将进行分析。
1. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是当前最为流行的基因编辑工具之一。
它可以利用“引导RNA”的帮助下，精确地切断DNA，进而编辑基因。
在实践中，CRISPR/Cas9已经被用于研究和治疗一系列疾病，包括癌症、代谢性疾病和免疫系统相关疾病等。
优点：（1）比较精确：CRISPR/Cas9能够在基因组的特定区域进行切割，实现对细胞基因的高精度编辑。
（2）操作简单：CRISPR/Cas9利用“引导RNA”指向的精确位置进行CRISPR酶的切割，操作起来比较简单。
（3）广泛应用：CRISPR/Cas9不仅被应用于人类基因编辑，还可以用于其他生物体。
缺点：（1）副作用：在编辑基因的过程中，可能会影响一些产生与目标无关的突变。
（2）递送：CRISPR/Cas9难以穿过细胞膜进行递送，这给人工干预基因的应用带来了难题。
2. TALENTALEN是一种用于基因编辑的人工核酸酶。
与CRISPR/Cas9相似，TALEN可以精确地切割基因组的特定区域，在研究和治疗疾病时也显得更为优化。
优点：（1）对测序敏感：TALEN可精确地判断基因组上哪些序列是需要编辑的，因此在编辑基因的过程中更加准确。
（2）可控性：TALEN对于切割的位置有更好的可控性，可以在任意位置进行。
缺点：（1）递送：TALEN也难以穿过细胞膜进行递送，研究人员需要寻找更加有效的递送方法才能使TALEN达到目标位置。
（2）操作复杂：TALEN的制造过程相对较为复杂，需要较高的技术要求。
3. ZFNZFN是第一个被发现并使用的基因编辑技术。
与TALEN和CRISPR/Cas9相比，它的应用范围相对较小。
基因编辑方法
基因编辑方法最近，基因编辑技术取得了快速发展，可以用来更快捷、更精确地调控基因表达，改变基因形态，从而获得更加有效的生物技术材料。
基因编辑有三种主要方法，即CRISPR-Cas9技术、TALENs技术和转基因技术。
CRISPR-Cas9技术是最先进的基因编辑技术，它可以实现精确操作和更深层次的基因编辑。
它属于基于抗原抗性基因条段转移素（CRISPR）技术，如今已成为一种有效的基因编辑技术，可以更精细地编辑和控制特定的基因序列。
这项技术通常包括两部分，即CRISPR-Cas9蛋白复合体和特定的基因编辑核酸（sgRNA）。
在使用CRISPR-Cas9的整个过程中，CRISPR-Cas9蛋白复合体可以根据sgRNA 中的信息来辨别和编辑特定的DNA序列。
由于CRISPR-Cas9蛋白复合体有自动编辑特定DNA序列的能力，因此它可以大大提高基因编辑的精确性和效率，同时也为基因编辑带来新的可能性。
TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）技术是一种用于基因编辑的第二技术，它可以利用自然界中存在的细菌被动免疫因子来实现基因编辑。
该技术通常包括两个部分，即TALEN 核酸和选择性编辑特定基因序列的TALEN蛋白复合体。
TALEN蛋白复合物可以根据TALEN核酸中的信息定位和识别特定的基因序列，然后将其修改或插入新的基因序列，从而实现基因编辑。
TALENs技术比CRISPR-Cas9技术更精确、更可靠，而且可以以不同的方式实现基因编辑。
转基因技术（rDNA）是最早发展的一种基因编辑技术，它的基本原理是利用质粒多样性，将基因组外的基因插入植物和动物体内，从而获得有效的基因编辑成果。
转基因技术一般通过将一只质粒放置到基因组中，再将一个携带特定基因的DNA片段插入到该质粒中，从而达到基因编辑的目的。
这项技术也可以用于添加、移除或更改特定基因序列，用于培育增强生活能力的物种。
三种基因编辑工具的比较
比较三种基因编辑技术一、基因编辑的概念基因编辑就是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。
利用该技术,可以精确地定位到基因组的某一位点上, 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。
此过程既模拟了基因的自然突变, 又修改并编辑了原有的基因组, 真正达成了“编辑基因” 。
目前主要有 3 种基因编辑技术, 分别为: a)人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases,ZFN)技术;b) 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases,TALEN)技术;c) RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases,CRISPR/Cas )。
二、三种基因编辑技术的介绍1、ZFN基因编辑技术ZFN 技术就是第一代基因组编辑技术,其功能的实现就是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。
ZFN 由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)与 FokⅠ核酸内切酶组成。
其中,由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。
于就是, 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制与非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。
HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。
两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。
2、TALEN基因编辑技术TALE(Transcription activator -like effectors):一种源于植物致病菌Xanthomonas sp、的靶向基因操作技术。
唯尚立德内部资料-TALEN CRISPR培训
Cas9-工作原理
Nature Biotech. 2012:30, 836–838
TALEN、Cas9/gRNA-神奇的基因剪刀
Double Strand Breaks (DSB) Repair（DNA双链断裂） 细胞内的DNA损失修复方式：
Double strand breaks (DSB)
Template
唯尚立德的大规模TALE制备技术
优势： 不同于传统的酶切连接方法，我们的方法利用在固相表面实现快速合成，实现 快速、高效大规模制备TALE, 一天可以合成上百条TALE Ref: Zhao Wang et al, An Integrated Chip for the High-throughput Manufacture of TAL Effectors. Angew. Chem. Int. Ed. 2012 (Accepted)
基因编辑中的最前沿技术
基因编辑中的最前沿技术基因编辑是当前生命科学领域最前沿的技术之一，它能够精确地修改生物体的基因组，从而达到治疗疾病、改良作物和促进人类基因组理解等目的。
目前最前沿的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9、ZFNs 和TALENs等。
CRISPR-Cas9技术是目前最常用的基因编辑工具之一，它由CRISPR序列和Cas9蛋白组成。
CRISPR序列能够与目标基因组特定区域匹配，而Cas9蛋白则是一种具有切割DNA能力的酶。
通过将CRISPR序列与目标基因组特定区域匹配，Cas9蛋白能够精确地切割DNA链，从而实现基因组的编辑。
利用此原理，我们可以增加、删除或修改基因组中的特定基因序列。
除了CRISPR-Cas9技术外，ZFNs和TALENs也是比较前沿的基因编辑技术。
ZFNs由锌指蛋白和核酸酶组成，通过设计锌指蛋白的结构，使其与目标基因组特定区域结合，再结合核酸酶切割DNA的能力，实现对基因组的编辑。
TALENs则是由转录激活因子样效应子（TALE）和核酸酶组成，通过设计TALE蛋白的结构，使其与目标基因组特定区域结合，再结合核酸酶切割DNA的能力，实现对基因组的编辑。
这些前沿的基因编辑技术正在被广泛应用于科学研究、医学治疗、作物改良等领域。
在医学领域，基因编辑技术可以用于治疗一些遗传性疾病，例如囊性纤维化、血友病和杜氏肌营养不良症等。
通过修改患者体内导致疾病的基因，基因编辑技术可以治愈这些疾病。
此外，基因编辑技术还可以用于癌症治疗、病毒抵抗、生物燃料生产等领域。
然而，基因编辑技术也面临着一些挑战和风险。
首先，基因编辑技术仍然存在脱靶效应和免疫反应等风险。
其次，对于一些复杂的遗传性疾病，可能很难找到导致疾病的单一基因。
此外，基因编辑技术的成本较高，目前还难以普及到所有患者和科研领域中。
总的来说，基因编辑技术是当前生命科学领域最前沿的技术之一，具有广泛的应用前景和潜力。
虽然存在一些挑战和风险，但随着技术的不断进步和应用的不断拓展，相信这些问题也将逐渐得到解决。
基因组编辑三大利器：TALEN、ZFN和CRISPRCas
变或取代原有的基因。（B）在缺失供体 质粒的情况下，NHEJ介导的修复会产生 小的插入或删失突变，并可能导致目标 基因被破坏；在有双链寡核苷酸或线状 供体质粒存在的情况
下，这些DNA片段可能通过NHEJ介导的 连接反应插入；同时诱导两个DSB的产 生则会引起删失、插入和易位突变。图 片来源：ThomasGaj,CharlesA.Ge
eringinDrosophila.NucleicAcidsResearc h,41(17):e163-171. 1.2.1构建TAL靶点识别模块 TAL的D
NA特异性识别单位是间隔32个恒定氨基 酸残基的二联氨基酸。二联氨基酸与 AGCT这4个核苷酸碱基有一一对应的关 系：腺嘌呤（A）由NI识别、胸腺嘧啶 （T）由NG识别
术的基本原理并不难理解，但其发现过 程却较为曲折。从1989年首次发现TAL 起，研究者前后历时近21年才研究清楚 TAL的工作原理。自2010年正式发明 TALEN技
术以来，全球范围内多个研究小组利用 体外培养细胞、酵母、拟南芥、水稻、 果蝇及斑马鱼等多个动植物体系验证了 TALEN的特异性切割活性。 2.1TALEN技术的应用
转录激活样效应因子核酸酶 （transcriptionactivatorlikeeffectornuclease,TALEN）技术与锌 指核酸酶（Zinc-fin
gernuclease,ZFN）技术组成了一大类强 有力的基因组编辑工具，这一大类技术 的发展重新划定了生物学研究的边界。 这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个 可编码的
2TALEN技术的原理与步骤 TALEN技术的原理并不复杂，即通过 DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性 的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶 的作用下完成
特定位点的剪切，并借助于细胞内固有 的同源定向修复（HDR）或非同源末端 连接途径（NHEJ）修复过程完成特定序 列的插入（或倒置）、删失及基因融合 （图2）。
基因编辑技术--ZFN TALEN CRISPR
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三、TALEN
• TALEN技术前景 • TALEN技术跟ZFN技术工作原理相似，但是有着明显的优势： • 1、TALEN结合DNA的方式更便于预测和设计； • 2、TALEN的构建更加方便、快捷，甚至能够实现大规模、高通量
基因编辑技术及其发展
汇报人：林武 日 期：2019.12.22
一、背景
• 基因组编辑 是近年基因工程技术的新发展，可通过对目的基因进行编 辑，包括特定DNA片段敲除、特异突变引入和定点DNA片段转入等， 从而实现对基因组的精确修饰，是在外源基因导入、基因打靶及RNA干 扰等技术之上发展起来的一项新技术。
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三、TALEN
图3 TALE靶位点识别模块
• TALEN技术原理及制备方法 • (一)TALE靶位点识别模块构建 • TALE的核酸识别单位为34个氨基酸
序列，其中的12、13 位点双连氨基 酸与A、G、C、T有恒定的对应关 系： • NG识别T、HD识别C、NI识别A、 NN识别G。
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三、TALEN
2011) • 规律成簇间隔短回文重复序列/Cas9系统( clustered rcgularly interspaccd
shortpalindromic repeat/Cas9, CRISPR/Cas9，2013)
2
一、背景
• 新技术为基因组定点修饰提供了可能：
• 当 核酸酶锚定 到基因组上的 特异性序列 时，可对目的基因组序列进行切割，从而 产生双链断裂(double strand break, DSB) ；基因组可通过非同源末端连接( nonhomologous ending joining, NHEJ)或同源重组( homologousrecombination, HR)的方式， 对DNA双链断裂进行修复，在基因组特定位点实现DNA的插入、替换或删除，从 而实现精确修饰。
基因敲除三大技术对比
1）全基因/条件性基因敲除大/小鼠
2）全基因/条件性报告基因敲除/敲入大/小鼠
3）CRISPR/Cas9粒构建
4）细胞系敲除/敲入
免疫类
B-NSG小鼠：Biocytogen-NOD-SCID-IL2rg
B-NSG小鼠是NOD遗传背景，Prkdc和IL2rg双基因敲除的小鼠，是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。
3Байду номын сангаас先全敲除再条件性敲除模式小鼠
4）基因敲入模式小鼠
5）ROSA位点定点转基因
TALEN技术
基因敲除效率高，速度快，可实现多物种基因敲除
基因敲入效率较低，多基因敲除困难，系统构建相对复杂，存在脱靶风险
1）全基因敲除大/小鼠
2）全基因敲除细胞系
EGE系统
基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，系统构建简单
•Il2rgnull：Interleukin-2受体的gamma链（IL-2Rγc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。
B-NSG小鼠：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。
•造血和免疫学研究
•人类疾病感染模型研究
IL17-EGFP knockin mice
Catalog number:BCG‐IM-0001
基因编辑技术的理论及应用探究
基因编辑技术的理论及应用探究Introduction:基因编辑技术是一种革命性的生物技术，通过修改生物体的基因组来改变其性状或特性。
该技术具有广泛的理论和应用前景，其研究和发展在医学、农业和生物能源等领域引起了广泛关注。
本文将探讨基因编辑技术的理论基础、操作原理以及其在医学和农业领域的应用。
基因编辑技术的理论基础:基因编辑技术主要基于两种理论：1）CRISPR-Cas9系统，2）锌指核酸酶（ZFNs）和转录活化酶（TALENs）。
1. CRISPR-Cas9系统:CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）和Cas9（CRISPR-associated protein 9）构成了CRISPR-Cas9系统。
该系统最初是从细菌免疫系统中发现的，用于对抗病毒。
CRISPR序列是细菌与病毒基因组之间的相互作用，而Cas9则是CRISPR序列的核酸内切酶。
CRISPR-Cas9系统利用从CRISPR序列获得的专门设计的RNA 引导Cas9蛋白到目标基因组中的特定位置。
一旦Cas9到达目标位置，它会通过特定的配对来识别目标DNA并实现切割。
之后，细胞的内部修复机制会填补切口，但也可能引发错误插入或替代，从而实现目标基因的编辑。
2. 锌指核酸酶（ZFNs）和转录活化酶（TALENs）:锌指核酸酶（ZFNs）和转录活化酶（TALENs）是另外两种基因编辑技术的理论基础。
这两种技术利用人工设计的蛋白质来靶向和修复目标基因。
ZFNs是利用锌指蛋白与内切酶融合，形成一种自定义的蛋白质来靶向修复基因。
TALENs则是利用转录活化因子与核酸酶融合，从而实现目标基因的编辑。
这两种方法都需要精确设计蛋白质与目标基因进行配对，以及一套复杂的实验操作。
基因编辑技术的操作原理:基因编辑技术的操作原理可以简化为三个步骤：1）设计和合成适当的基因编辑工具，2）将编辑工具转导到目标细胞，3）进行目标基因的编辑。
三种基因编辑工具-ZFN.TALEN.CRISPR-Cas
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CRISPR技术改造的水稻
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CRISPR/Cas9技术方案
• 利用设计向导RNA的免费软件设计single-gui 编码Cas9蛋白酶的质粒或mRNA
• 转染细胞：guide RNA+编码Cas9蛋白酶的质粒或mRNA
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TALEN原理
TALEN=DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识
别并结合一个对应的碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA
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TALEN原理
全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 • NG可以识别T • HD可以识别C • NI可以识别A • NN可以识别G或A 通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，
TALEN
TALE（Transcription activator -like effectors）:一种源于植物致病菌的靶 向基因操作技术。 科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas sp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱 基，简单且特异性极好。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的 表达调控。 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得 到成功应用。
• 成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上 • 打靶效率高，可完全替代RNAi技术 • 脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应 • 周期短，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒
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CRISPR/Cas系统
TALEN靶向基因敲除技术
TALEN靶向基因敲除TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)，中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于一种由植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的天然蛋白即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。
人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就生成了TALENs。
TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。
相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。
但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。
TALEN 靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。
研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。
研究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。
成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。
技术特点：·无基因序列、细胞、物种限制。
·实验周期短。
·整个实验简单准确，成本低。
·成功率可达90%以上。
·毒性低、脱靶情况少。
·TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
·靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。
三种基因编辑工具的比较
三种基因编辑⼯具的⽐较⽐较三种基因编辑技术⼀、基因编辑的概念基因编辑是指对基因组进⾏定点修饰的⼀项新技术。
利⽤该技术，可以精确地定位到基因组的某⼀位点上，在这位点上剪断靶标 DNA ⽚段并插⼊新的基因⽚段。
此过程既模拟了基因的⾃然突变，⼜修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。
⽬前主要有 3 种基因编辑技术，分别为： a)⼈⼯核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术；b) 转录激活因⼦样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技术；c) RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas )。
⼆、三种基因编辑技术的介绍基因编辑技术ZFN 技术是第⼀代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋⽩发展起来的。
ZFN 由特异性识别序列的锌指蛋⽩(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。
其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，⽽由FokⅠ构成的切割域能执⾏剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。
于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和⾮同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。
HR 修复有可能会对靶标位点进⾏恢复修饰或者插⼊修饰，⽽ NHEJ 修复极易发⽣插⼊突变或缺失突变。
两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的⽬的。
基因编辑技术TALE（Transcription activator -like effectors）:⼀种源于植物致病菌Xanthomonas sp.的靶向基因操作技术。
基因编辑技术在动物基因功能研究中的应用
基因编辑技术在动物基因功能研究中的应用随着分子生物学和基因组学技术的快速发展，基因编辑技术已经成为一种越来越受欢迎的工具。
这项技术可以在细胞和生物体中通过刻意引入、修改或删除特定的DNA序列来实现诱导突变和纠正突变，从而加深我们对基因功能的理解。
基因编辑技术主要分为三种类型：锌指核酸编辑、TALEN编辑和CRISPR编辑。
其中，CRISPR编辑被认为是最简单、最精确的一种。
近年来，基因编辑技术在动物基因功能研究中的应用越来越受到关注。
1. 基因靶向敲除和敲入基因靶向敲除和敲入是两种常用的基因编辑技术。
敲除技术用于切断或删除特定基因的DNA序列，以便研究其功能。
相反，敲入技术通过向原基因添加DNA 序列来修改基因功能。
在动物研究中，这两种技术通常用于破坏或修复致病基因。
例如，在研究心脏和血管病理学时，敲除和敲入技术可以帮助研究人员研究特定基因或信号通路对心血管功能的影响。
2. 先天性疾病的研究先天性疾病指出生时就存在的疾病。
基因编辑技术可以用来模拟和研究这些疾病。
通过对动物胚胎进行基因编辑，研究人员可以创造模拟人类先天性疾病的动物模型，进一步探究其相关疾病的发病机制。
例如，对于唐氏综合症、神经纤维瘤病等疾病，基因编辑技术可以模拟这些疾病和研究它们的发生过程。
这种技术可以为研究人员提供更好的遗传模型，帮助人们更好地理解和防治这些疾病。
3. 基因治疗基因治疗是指通过对人体基因进行修改和纠正来治疗疾病。
基因编辑技术可以用于开发新的基因治疗方法。
例如，基于CRISPR编辑技术，科学家已经证实可以在人类细胞中纠正无力症或囊性纤维化等疾病相关的基因突变。
这些研究为我们开启了一扇治疗这些疾病的新窗口。
同时，基因编辑技术的应用也存在一些争议。
首先，如果应用不当，可能会造成非预期的基因突变。
另外，人们也对基因编辑行为的道德和法律问题产生了许多担忧。
总之，基因编辑技术在动物基因功能研究中具有广泛的应用，这为我们更好地理解基因功能、疾病的发生机理和治疗提供了新的契机。
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The sgRNA is a 102-nt-long chimeric noncoding RNA, consisting of a 2025nt target-specific complementary region, a 42-nt Cas9-binding RNA structure and a 40-nt transcription terminator derived from S. pyogenes. The PAM sequence, consisting of a 2- to 5-bp recognition site that varies depending on the CRISPR system and the host organism, is a key motif that is recognized by the CRISPR machinery for spacer acquisition and subsequent NGG tar -get interference. 42nt
TALEN核酸酶
DNA 识别域 TALE
A T T C T G C T A A C T C A T A C
DNA剪切域 FokI NI C’ HD NG NN → → → → A C T G
N’
LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
TALE domain: DNA 识别域
CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列 (spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是 由间隔序列（spacer）决定的。这种免疫功能的有无是由CRISPR 间隔序 列的动态性变化决定的，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。
TALE应用展望-TALEX
将识别特定DNA序列的TALE蛋白与不同的蛋白酶融合，实现不同的靶向 基因操作的应用： 1. 调控控表达的TALEN或TALEA--->TALEL 2. 抑制基因表达 ---> TALER 3. 敲除基因 ---> TALEN 4. 启动子附近的甲基化 ---> TALEM 5. 特定序列的重组酶 --->TALER 6. 。。。。。。
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！
3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。
RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸 二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。 RNase A是一种被详细研究和具有广泛应用的核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解 作用，但对DNA则不起作用。
CRISPR/Cas9 System
We targeted the rice bacterial blight susceptibility gene Os11N3 (also called OsSWEET14) for TALEN-based disruption. This rice gene encodes a member of the SWEET sucrose-efflux transporter family and is hijacked by X. oryzae pv. oryzae, using its endogenous TAL effectors AvrXa7 or PthXo3, to activate the gene and thus divert sugars from the plant cell so as to satisfy the pathogen‘s nutritional needs and enhance its persistence. The Os11N3 promoter contains an effectorbinding element (EBE) for AvrXa7, overlapping with another EBE for PthXo3 and with the TATA box.
TALEN assembled vectors Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12
FokI
N’
C’
亚克隆到植物表达载体上
通过Ti载体介导转 染插入植物基因组 中，然后表达目标 蛋白-TALEN， TALEN剪切DNA， 造成突变体。最后 通过交配将TALEN 去除，达到无痕基 因敲除的目的。
Os-11N3插入突变或者被RNA介导沉默后，对那些依赖AvrXa7和PthXo3的致 病小种的特异感病性丧失。
We deployed two pairs of designer TALENs (pair 1 and pair 2) independently to induce mutations in these overlapping EBEs of the Os11N3 promoter and thus to interfere with the virulence function of AvrXa7 and PthXo3, but not the developmental function of Os11N3.
如果改造成我们的目的 基因，就可以定向的进 行基因修饰
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用 设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。
我们不再大海捞针！！！
TALE的发现迅速成为科技最前沿
TALEN技术形成的关键研究
Sugisaki Hiroyuki 发现FokI核酸酶 （1981）
Jens Boch 破译TALE序列 （2009）
Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011)
Removal of T-DNA sequences containing TALEN genes from TALEN-modified rice plants using genetic crossing.
TALEA-人工转录因子-提高内源基因的表达
将识别特异DNA序列的TALE与转录激活因子VP64 融合，表达 的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列， 并通过VP64激 活区域与Pol II 结合，激活基因的转录，提高了内源目标基因 的表达。
x4 x16
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一步连接
只要4-5小时，这些片段就全部连接 N’ Promoter
TALEN backbone vectors
CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6
1/2
FokI
C’
Promoter
TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas – 用于调控宿主基因 由34 个氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位点不同
Nuclease domain: DNA剪切域
FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切
TM连接TALEN FastTALE
Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Position 5 Position 6 Position 7 Position 8
Position 9
TALEN modules at 9 positions 9 x 16 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，
发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA
片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列，正功能。
2013以后，研究者们在包括《science》和《nature
biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas
系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确 的基因修饰。
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和 核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。
美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶