第十二动物细胞的大规模培养技术

第十二动物细胞的大规模培养技术大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。

基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。

然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。

而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。

利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。

因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。

实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。

一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1—2L。

用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。

利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。

单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。

因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。

应用细胞工程技术，建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。

据不完全统计，全世界现有一万多个实验室，400多家工厂从事生物技术产品的研制。

近几年来，已研制了几种具有很大前途的技术。

具有代表性的有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统以及中空纤维培养系统。

上述五种培养系统均能生产不同的生物制品，它们具有不同的技术特点，但仍需不断完善。

中空纤维培养系统和大载体培养系统较为先进，用途更广，似乎更有发展前途。

一、大规模细胞体外培养系统的基本要（一）新型培养系统的设备现有的常规搅拌式发酵罐不能满足现代生物技术在体外大规模培养动物细胞的技术和经济要求，必须加以改造，以达到模拟动物体内细胞高密度的生长环境，扩大体外培养细胞的表面积和增加细胞密度同体内细胞一样生长。

无菌操作安全可靠、保温和气体交换系统优良，可靠的泡沫控制和适于大批量的混合装置，能保证pH值之稳定；抗泡沫剂、氧气和温度等监测并使其尽快地达到均一。

清洗方法简便快速，监视控制自动化，制造用料合适；方法合理，成本低；体积要小而使用方便，并适于多种产物的使用；便于扩大生产等。

根据上述要求，要研制一台理想的细胞培养系统需要多学科的专家，如生物学家、机械学家、电子工程技术专家共同研究、设计，并与生产部门密切合作才能达到要求。

(二)细胞株(系)的选择微生物污染是大规模细胞培养的主要危险。

设备、培养液、支持系统和操作方法的复杂性都会引起微生物污染。

其中支原体对动物细胞培养威胁最大。

因为它们的感染力很高又不易被检测。

因此，细胞在使用前必须经过严格的检测。

另外，细胞在体外生长时要保持良好的生长速率和分泌功能。

为了保持高产稳产的细胞株(系)，应该定期进行筛选工作；为了防止意外事故发生，应将没有支原体污染的细胞定期进行低温保存。

(三)培养液的选择培养液选择一般是根据所采用的细胞株(系)而定，在原来的基础上加以改良，达到规模培养细胞的要求。

大规模培养细胞的培养液中，血清用量大，质量不易控制，生产成本也高，且使产品的后加工增加了一定的难度。

为了减少血清用量，就要逐步驯化细胞，使其适应于低血清或无血清培养液。

现有两类适用于某些动物细胞的无血清培养液：一种是用激素或其他大分子加入培养液；另一种是以特殊的营养物质(如小牛淋巴液等)替代合血清的培养液配方。

利用这两种培养液培养某种细胞都获得了满意结果。

但是，值得注意的是在无血清培养液中更可能出现细胞毒(这与水中的微量元素或有机物污染有关)。

因此，在培养液制备时必须采用高纯度的水。

培养液一般需经o．22／μm的微孔滤膜过滤消毒，最近美国Millip公司生产一种0．1μm的多层正压过滤器能除去支原体的污染。

(四)细胞生长状况的监测1．温度控制动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。

温度低于370c，细胞生长缓慢；温度高于’37cc，细胞失去存活力。

因此，动物细胞培养比多数微生物培养对温度控制具有更为严格的要求。

一般培养液温度由铂电阻温度计来监测，其灵敏度为±0．025Gc。

温度计信号经微机反馈控制器处理后控制反应器的能量输入。

培养容器的温度控制误差约在i ±0．05cc之内。

大多数加热器固定在容器外面，带有大面积衬垫。

采用这样的加热系统可提供大的热交换表面，消除局部热点，减少温度梯度的形成。

2．pH控制pH值是细胞培养的关键性参数。

它影响细胞的存活力、生长及代谢。

细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，范围为7．0—7．5左右。

缓冲液系统通常用C02、碳酸氢盐调节，pH值取决于培养液中的C02和碳酸氢盐的浓度比。

加入C02即pH值降低，而加入碳酸氢盐则使pH值升高。

在培养初期阶段细胞产生的C02和乳酸量较少，C02可以从系统中置换出来。

在细胞生长的后期阶段，细胞密度增加，由于细胞产生的cob和乳酸量增加，使pH值变得偏酸。

这可根据需要用加酸或加碱液的方法，对pH值加以控制。

但此法有产生局部pH值和增加培养液渗透压的危险。

控制pH的较安全的办法，是通过供给细胞所需的氧而改变通人反应器气流中的C02浓度。

用C02控制pH值会强烈地受溶氧控制系统的影响，这因为控制溶氧(空气、N2或02)而加入的任何气体都将导致C02的被置换，从而引起pH值升高。

因此，在设计pH值控制系统时，应顾及溶氧控制。

3．溶氧(DO)的测量与控制溶氧是细胞代谢中的重要养分。

它可以影响细胞的产率，且间接或直接地影响细胞的代谢。

在低氧压下，细胞往往生长缓慢。

而氧压过高，使培养液会变得对细胞具有毒性。

人们已发现溶氧的最适水平是依赖于不同细胞的类型，空气饱和度应在10—l00%的范围内。

可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气控制溶氧。

值得注意的是，pH值控制可以影响溶氧控制。

在设计过程中应有一种控制器，通过调节输入反应器的空气、氧气、氮气和二氧化碳各类气体的混合比例，使溶氧与pH值的控制结合在一起。

4．葡萄糖和乳酸的监测为了及时了解大规模培养细胞的健康状况，应逐日或隔日吸取培养浓样品进行乳酸的产量及葡萄糖摄人量的测定，以便监测细胞生长的动态状况。

操作方法可参照Sigma技术报告。

5．产物的收集和检测根据大规模培养系统中的pH、D0数值及葡萄糖、乳酸等参数的动态变化，监控细胞生长状况，并定期抽样检测细胞分泌产物的含量。

应用不同类型的细胞，采用不同的产物检测方法。

一般用免疫荧光间接法、血凝法、免疫酶标法以及放射免疫法等。

一般产物的收集可采用批量收集和微机程序控制连续收集两种方二、几种大规模细胞培养系统(一)气升式深层培养系统英国celltech公司研制的全自动气升式深层培养系统有独到之处，在国际上居领先地位。

几年来该公司研制这种培养系统从5l，301，100L到1000L6到1985年底已建成具有5个1000L气式培养系统的车间。

气升式培养系统中是使用低血清或无血清培养液。

每次培养周期为两周。

每升培养液可生产40—500mg的单克隆抗体，若其产量恒定，平均为102mg。

10L培养系统一年可生产508单克隆抗体，100L生产500g，而1000L则可生产5kg。

全自动气升式深层培养系统为全部密闭结构。

混合气体自培养器底部管道输入，气体沿着培养器中央的内管上升。

一部分气体从培养器的顶部逸出，另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降，直达培养器底部和新吹入的气体混合而再度上升。

这样借助气体的上下不断循环搅动培养器内的细胞，使之不贴壁。

通过微机程序控制混合气体的组分，维持培养液内一定的溶氧张力和pH值。

该系统具有几个优点：1)没有移动部件；2)完全密封；3)便于无菌操作；4)不易污染；5)设计简单；6)便于放大生产；7)氧的转换率等，满足了该培养系统中细胞在生长时所需的要求。

(二)微载体培养系统微载体大规模培养动物细胞是1967年Van Wezel首先创立的一种方法。

其基本原理是利用固体小颗粒作为载体，细胞在载体的表面附着，通过连续搅拌悬浮于培养液中。

并成单层生长繁殖。

由于扩大了细胞的附着面，能充分利用生长空间和营养液，因此大大提高了细胞的生长效率和产量。

微载体是由天然葡萄糖聚合物(葡聚糖)或者各种合成的聚合物组成的，其直径由50μm到数百微米不等。

目前商品化的微载体有CytodexI，II，III，biocarrier，gelibead以及DEAE—cellul03e等。

该系统具有的特点：1)表面积增大；2)生长环境均一，条件易于控制；3)取样及细胞计数简单；4)细胞与培养液易于分离；5)大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可；6)适合于培养原代细胞、二倍体细胞株，它对生产重组产品来说是必不可少的有效方法。

朱德厚等(1982)根据微载体培养的原理，自行设计一套微体悬浮培养系统，选用DEAE—sephadex—A50及Cytodex—I两种微载体，以每瓶100一120Ing ／I 00万细胞的浓度，转速50r／min，37cc恒温条件下培养Hela(入子宫颈癌细56)、BEL—7402(人体肝癌细胞)及CBRH—7919(大鼠肝癌细胞)三种细胞系，结果表明，培养5—7天内其产量分别可增加63．5，31及95倍，远较文献报道为高。

95%的微载体上都有培养细胞茂密生长繁殖，并进行直接分裂及有丝分裂，活细胞率在90%以上，且有进行亮氨酸掺入的功能。

同时，测定培养细胞总蛋白量及同位素掺入量，可作为判定细胞实际产量和功能状态的指标。

该培养系统为细胞生钩学研究和病毒及其他生物制品的生产提供了大量的细胞，且可为某些不能在悬浮培养情况下生长的细胞，如原代细胞、二倍体细胞的转向悬浮培养及大量繁殖提供有效的手段。

图12—1 悬浮培养瓶图12—2 悬浮培养装置(三)微囊培养系统70年代，Lin和sun把生物活性物质、完整的话细胞或组织包在薄的半透膜中，即称为微囊技术。