缢蛏_Sinonovaculac_省略_微卫星标记的分离及近缘物种通用性_吴雪萍

第45卷 第6期 海 洋 与 湖 沼

Vol.45, No.6 2014年11月

OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA

Nov., 2014

*山东省农业良种工程课题“优质高产抗逆贝类良种选育”, 2009—2013; 山东省自然科学基金, ZR2012CM037号; 泰山学者岗位“水生动物营养与饲料”, 2008—2013; 国家自然科学基金项目, 31060353号。吴雪萍, 硕士研究生, E-mail: ab8711xp@

① 通讯作者: 刘相全, 副研究员, E-mail: lxq6808@; 潘英, 教授, E-mail: nnpying@

收稿日期: 2013-12-15, 收修改稿日期: 2014-02-19

缢蛏(Sinonovacula constricta )微卫星标记的

分离及近缘物种通用性*

吴雪萍1, 2 马海涛2 冯艳微2 刘相全2①

潘 英1①

(1. 广西大学动物科学技术学院 南宁 530004;

2. 山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室 烟台 264006)

提要 采用磁珠富集和PCR 筛选相结合的方法, 得到12对缢蛏(Sinonovacula constricta )的多态性微卫星引物。每个位点的观测等位基因数为2—15个, 有效等位基因数为1.0339—8.8063个; 观测杂合度(H o )为0.0333—1.0000, 平均观测杂合度为0.7525; 期望杂合度(H e )为0.0333—0.9020, 平均期望杂合度为0.6866; 多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中, 有8个位点属于高度多态位点(PIC>0.5), SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC<0.25); 经Bonferroni 校正后, 无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点; 连锁不平衡检验结果表明, 位点间不存在连锁不平衡现象。此外, 分析了这些引物在近缘种长竹蛏(Solen strictus )、大竹蛏(Solen grandis )和小刀蛏(Cultellus attenuatus )的通用性情况, 结果显示: 长竹蛏中, 位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态(PIC>0.5); 在大竹蛏中, 位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC2-9为低态位点(PIC<0.25); 在小刀蛏中, 位点SC1-7、SC2-9、SC3-4、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC4-6为低态位点(PIC<0.25)。

关键词 缢蛏; 长竹蛏; 大竹蛏; 小刀蛏; 微卫星标记; 通用性 中图分类号 S968.3 doi: 10.11693/hyhz20131200199 缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)俗称蛏子, 属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、竹蛏科(Solenidae)、缢蛏属(Sinonovacula ), 在中国和日本沿海均有分布, 为广温广盐性的海产双壳贝类。其肉味鲜美, 营养丰富, 具有食用和药用价值, 是中国四大养殖贝类之一。近年来, 无序养殖、盲目移种, 以及海洋资源的过度捕捞和海水环境污染的加剧, 造成缢蛏种质资源混杂和野生群体数量衰减(刘博等, 2013)。

微卫星DNA 是指以少数几个核苷酸(多数为2—6个)为单位的多次串联重复的DNA 序列, 亦称简单

重复序列(simple sequence repeats, SSR)、短串联重复(short tandem repeats, STR)、简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism, SSLP)等。由于其遵循孟德尔遗传规律, 具有共显性、高度多态性、数量丰富、可重复性强等特点, 已经被广泛应用于贝类遗传多样性分析及遗传连锁图谱构建等方面的工作。关于缢蛏微卫星标记的开发, 仅有少数学者作了相关报道: 牛东红等(2008)利用磁珠富集法和PCR 筛选法开发了18对微卫星引物; Jiang 等(2010)利用磁珠富集法开发了14对微卫星引物; 刘博等(2012)从EST 数据库中开发了14对多态性引物并对乐清湾缢蛏群体进行多样性分析。但这些标记远不能满足其遗

6期吴雪萍等: 缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星标记的分离及近缘物种通用性 1331

传图谱构建及数量性状位点定位(QTL)等方面的研究, 急需开发出更多的微卫星标记。本研究利用磁珠富

集和PCR筛选相结合的方法, 快速分离得到12对

微卫星引物并在长竹蛏(Solen strictus)、大竹蛏(Solen grandis)和小刀蛏(Cultellus attenuatus)进行通用性

分析。

1材料与方法

1.1材料

缢蛏、长竹蛏及大竹蛏活体样品均采自山东省烟台市, 小刀蛏活体样品采自东营市, 取其闭壳肌保存于75%酒精中, –20°C备用。

1.2缢蛏基因组DNA的提取及酶切

利用北京天根海洋动物组织基因组提取试剂盒提取缢蛏基因组DNA后, 再用限制性核酸内切酶Sau 3AI对至少5μg的DNA进行酶切, 反应总体积50μL, 包含: 10×buffer (TaKaRa) 5μL, DNA模板40μL, Sau 3AI 0.6μL, 超纯水4.4μL。经1.2%的琼脂糖凝胶检测酶切完全后, 使用生工生物(上海)有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收400—1000bp片段。

1.3接头序列的制备及连接

等摩尔混合两条寡核苷酸链Sau A: 5’-GATCGT CGGTACCGAATTCT-3’, Sau B: 5’-GTCAAGAATTC GGTACCGTCGAC-3’, 经95°C变性10min后, 室温放置4—5小时使其复性。回收产物与双链接头的连接采用10μL的反应体系, 包含: 接头5μL; 胶回收DNA 3μL; 10×buffer (Takara) 1μL; T4连接酶(Takara) 1μL, 16°C过夜连接。

1.4第一次PCR扩增及纯化

PCR反应的总体积为25μL: 去离子水13.6μL; 5×buffer (promega) 5μL; dNTP 1μL; Mg2+ 2μL; Sau A (10μmol/L) 2μL; 目标DNA 100ng; Taq酶(promega) 0.4μL。

PCR程序为94°C预变性5min, 94°C 50s, 60°C 50s, 72°C 1min, 30个循环, 最后72°C延伸10min。1.5磁珠富集

磁珠(Promega)上包被的链霉亲和素(Strep tavidin)可与探针(CA)16和(GA)16上的生物素(biotin)结合, 从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。

1.5.1PCR产物变性与杂交探针杂交体系为100μL: PCR纯化产物10μL, 生物素标记的DNA探针(CA)16和(GA)16各200pmol, 20×SSC 15μL。杂交液放入PCR仪中95°C变性5min, 迅速置于冰上冷却后, 68°C温浴1h。

1.5.2磁珠准备取一管新鲜的磁珠(Promega), 轻柔混匀磁珠悬浮液, 吸取100μL放入1.5mL灭菌离心管中, 在磁力架上除去上清后, 用100μL 0.5×SSC清洗3次并除去上清。

1.5.3富集

(1) 将杂交混合液加入到磁珠管中, 25°C放置30min, 每10min 混匀1次, 除去上清;

(2) 用100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次4min;

(3) 用100μL 3×SSC, 68°C清洗2次, 每次13min;

(4) 用 100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次8min。

1.5.4捕获含微卫星序列的单链DNA 除去上清, 加入30μL灭菌水, 转入PCR管, 95°C热洗脱10min, 迅速吸取上清液至另一灭菌1.5mL离心管中, 即为杂交后单链DNA。

1.6第二次PCR扩增含微卫星序列的DNA片段

以Sau A为引物, 对富集的DNA单链片段进行PCR扩增, 25μL反应体系: Sau A 2μL, 5×buffer (Promega) 5μL, dNTP 1μL, Mg2+2μL, 目标DNA 6μL, Taq酶0.4μL。1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后经生工生物(上海)柱式PCR纯化试剂盒去除多余的dNTP、Sau A等, 置于4°C备用。

1.7富集片段的T载体连接和转化

使用 pMD TM 20-T Vector Cloning Kit (Takara)对纯化后的DNA片段进行连接。载体连接的反应体系为10μL: pMD TM 20-T Vector 1μL; solution I 5μL; 纯化DNA 4μL。16°C反应连接过夜。将全部连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 37°C 振荡培养箱培养1h, 菌液涂于含有IPTG、X-gal的氨苄青霉素抗性LB平板上, 37°C培养12h, 挑取阳性克隆在含LB液体培养基(含氨苄青霉素抗性)的96孔细胞培养板中, 37°C培养12h。用载体引物M13-47、RV-M及无生物素标记的探针序列(CA)12或(GA)12对随机挑选的白斑克隆进行PCR菌落鉴定。扩增得到的PCR产物通过1.2%琼脂糖电泳检测后, 克隆中若存在相应微卫星核心, 每条产物带应为2条或2条以上。将符合上述条件的菌落送往上海英俊生物公司测序。