高通量药物筛选利器——HTRF 原理介绍
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HTRF 技术介绍
快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得Cisbio 的HTRF 技术一直是药物研发领域的领先技术之一,并广泛用于信号转导研究和免疫检测。该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。
HTRF (均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。
该技术结合了荧光共振能量转移(FRET ,
Fluorescence Resonance Energy Transfer )
和时间分辨荧光 (TRF, Time-Resolved
Fluorescence))两种技术。这种结合将FRET
的均相实验方式和TRF 的低背景特点融合在一
起,使得HTRF 技术拥有如下优势:操作简单、
灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳
性率较低。HTRF 是基于TR-FRET 的化学技术,拥有与其它TR-FRET 技术相似的特征,包括使
用镧系元素(铕和铽),具有非常长的半衰期,很大的Stroke's shift (如图1所示,Eu 3+ Stroke’s shift > 300 nm )等。除此之外,它还有其独特的性质,从而与其它技术区分开来。这主要表现在HTRF 的镧系元素与络合的穴相结合,而不是像其它所有TR-FRET 技术使用螯合物。螯合物在溶液中是一种动态平衡,在特定条件下不稳定;而HTRF 中应用的穴与镧系元素是永久地嵌合,非常稳定,可耐受较宽的pH 范围、二价金属离子如Mn 2+等、螯合剂如EDTA 等。HTRF 的独特之处还包括对数据的专利的比值处理方法,其能校正样品基质不同等带来的干扰。 FRET 技术简介
FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为(能量)供体和(能量)受体,前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。供体被外来能源激发(例如闪光灯或激光),如果它与受体在足够近的距离之内,可以将能量共振转移到受体上。受体受到激发,发出特定波长的发射光。
将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离,产生能量转移。这时,我们可以检测到两个发射光,分别
为受体和供体的发射光。由于受体分子的发射光来自于能量转移,所以在
图1:铕穴状化合物的激发和发射光谱
实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单,而且减少了实验时间和花费。如果与供体和受体结合的生物分子不存在相互作用,供体和受体距离较远,不能产生能量转移,则只能检测到来自于供体的发射光,如图2。
一般地,在FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团,半衰期非常短,背景荧光较强。背景荧光主要来自于荧光染料本身的干扰,以及样品成分的荧光和自发荧光,后者包括缓冲液、化合物和样品中的蛋白质、脂质、糖类等等的荧光信号。实验检测到的荧光信号必须对这些自发荧光进行校正,极大地影响了实验灵敏度,并使数据分析变得复杂。
HTRF 技术使用镧系元素作为供体,其属于长寿命荧光,可通过时间延迟的检测方式将背景荧光去除,提高了灵敏度,并使数据真实可靠。
TRF 技术简介
如前所述,样品中的很多成分具有较强的荧光和自发荧光,利用传统的快速荧光基团进行检测极大地限制了实验灵敏度,并且不能反映样品的真实情况。使用长寿命的荧光基团结合时间延迟的检测方式(在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟)可将快速荧光的干扰降到最低。
图2:FRET 技术的原理
时间延迟的检测方式,是通过时间分辨荧
光(TRF )技术实现的,其利用稀土元素中
镧系元素的独特性质。在TRF 中常用的镧
系元素是钐(Sm )、铕(Eu )、铽(Tb )和
镝(Dy )。与传统荧光基团相比,它们具有
大的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期(从微秒到毫秒)。镧系元素的Stoke's
shifts 通常为300 nm ,检测的发射光中没
有来自于激发波长的干扰。HTRF 技术中镧系元素的半衰期大于1毫秒,与普通荧光纳
秒级的半衰期相差6个数量级。当延迟50微秒读数时,普通荧光的信号近似于零,镧系元素的信号改变很小。所以,HTRF 技术的数据真实可靠,假阳性低。
为了能够成功应用于生物学检测中,稀土元素复合物应该具有特定的性质,包括较强的稳定性、较高的发射光产率,并且能够与生物分子连接。除此之外,当直接在生物溶液中检测时,能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物在特定条件下稳定性较差,并且有的化合物与螯合物活性基团发生反应,产生竞争,增加了其不稳定因素。HTRF 技术应用穴状化合物,整个体系非常稳定,没有光漂白现象,可在至少48小时内反复多次检测。
HTRF 技术的能量供体(Donor )和能量受体(Acceptor )
HTRF 的供体是铕穴状化合物(Eu 3+ cryptate )或Lumi4™铽穴状化合物(Tb 2+ cryptate ),后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果,激发效率更高。两者的能量受体(Acceptor )均可为XL665和d2。XL665和d2激发波长为620 nm ,发射波长为665 nm ,位于近红外光区,进一步降低了样品本身对实验的影响(生物学样品很少在近红外光区有自发荧光)。对于铽穴状化合物来说,其受体也可以是Fluorescin 、GFP 等发绿色荧光的分子,所以可以进行双标记测量。XL665是改良过的别藻蓝蛋白(APC ),其将APC 的亚基偶联,使其不能解离,增加了稳定性。d2是第二代受体,光谱学特征与XL665相同,但是分子量较小,约为1KD ,可减少空间位阻对实验的可能影响。
当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时,在激发时被穴状化合物捕获的能量部分释放,发射波长为620 nm ;另一部分能量共振转移到XL665或d2,使其发光,发射波长为665 nm 。665 nm 的发射光仅仅由穴状化合物作为能量供体的FRET 产生。所以,当生物分子相互作用时,有两个激发光620 nm 和665 nm ;
图3:TRF 技术的原理 图3:TRF 技术的原理