PI染色检测细胞周期实验步骤
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protocol : PI染色检测细胞周期
1、收集细胞:胰酶(含EDTA)消化收集对数生长期细胞(加热处
理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个),吸取旧培养基到一个新离心管里;少量常温PBS (根据培养皿大小决定量,PBS洗可以保证消化效率)洗2次,清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化
(注意一定要消化完全,显微镜下观察细胞呈单个,而不是成片脱落)后利用旧培养基中和胰酶;离心(1000r/300g 5mi n)收集细胞沉淀。
2、用预冷的PBS清洗细胞两次。
3、固定细胞:用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀,使细胞充分悬浮成单细胞,再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%),吹打混匀以免细胞团聚,4C固定2H至过夜。
4、细胞染色:离心(1000r/300g 5min )收集固定的细胞,以1.8 mL的PBS洗细胞一次,离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来,但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min,最后加入400卩lPI避光染色30 min (常温或4C 均可)
【有的试剂盒说明是:每个样本加入500uL染色剂(据样本数,用P
BS 临时配好总量,其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ) 4 C避光染色30分钟】
5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结
果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时,使用FL2-W和FL2-A显示,去除联体细胞。