流式检测细胞周期和凋亡实验步骤

流式细胞技术检测细胞周期分布

1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀；

2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶；

3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜；

4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇；

5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。

6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。

2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平

1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常

2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内；

3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min；

4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育；

空白：Annexin V—FITC结合液200ul

双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI

单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC

190ul结合液+10PI

5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。