血栓心脉宁片激活Nrf2及其下游基因

血栓心脉宁片激活Nrf2及其下游基因可能与血栓心脉宁片在HUVECs中的抗氧化活性相关吉林大学基础医学院病原生物学系熊凌锌谢婧书宋晨雪郑敬彤张晓天王放吉林大学药学院刘金平刘传贵李平亚流行病学研究表明,抗氧化活性在保护血管内皮细胞中扮演重要角色。

本试验的目的在于研究传统中药血栓心脉宁片（XXT）的抗氧化活性和Nrf2（转录因子NF-E2 相关因子）调控基因的差异性表达。

结果表明,XXT 可强烈激活Nrf2 及其下游调控基因，这可能与XXT 的抗氧化活性及血管内皮细胞的保护活性相关。

前言十多年来，因XXT可促进血液循环、去除血瘀，在中国被广泛应用于脑血栓和冠心病的治疗。

氧化与包括高血压、高胆甾醇血症在内的所有的心脑血管疾病有关，可通过激活产生活性氧（ROS）的NADPH 氧化酶参与这些疾病的形成。

因此，我们研究XXT的体外抗氧化活性。

Nrf2系统被认为是一种主要的抗氧化保护机制，在细胞防御中发挥作用，也可通过激活编码Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的基因促进ROS的去除。

通常条件下，Nrf2与可结合肌动蛋白的Keap1 结合，二者形成Keap1-Nrf2 复合体。

这种复合体可阻止Nrf2进入细胞核，促进其蛋白酶降解。

当用包括H2O2在内的氧化物刺激细胞时，氧化应激和构象变化可作为硫醇敏感型氨基酸的氧化结果，并驱使Nrf2与Keap1分离。

随后Nrf2转移至细胞核，结合ARE靶基因的抗氧化反应成分（ARE），导致抗氧化酶表达上调。

在本试验中，我们旨在研究可控制抗氧化基因和ROS 的Nrf2 及其下游基因的转录调控，并研究XXT的抗氧化活性是否受Nrf2的调控。

研究方法细胞培养和用药在加15%胎牛血清的IMDM培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（37℃、5%CO2）。

测试期培养基用含2%FBS的IMDM换液。

将所培养的细胞分为5组：对照组（NC）、氧化应激模型组（Model）、三个XXT加药组（包括高剂量组（200 μg/ml）、中剂量组（100 μg/ml）和低剂量组（50 μg/ml）。

NC组细胞用0.2 mM H2O2处理4h，XXT加药组细胞在H2O2 处理24h 前用XXT（200、100、50 μg/ml）预处理。

H2O2的浓度根据H2O2的IC50 确定，但XXT 的浓度根据筛选研究确定。

用MTT法评估细胞存活。

细胞内ROS 水平的检测用ROS 试剂盒检测HUVECs细胞中的ROS水平。

为了检测ROS水平，加药20 min后将HUVECs于37℃黑暗环境中的10μM DCFH-DA 孵育。

随后流式检测细胞。

氧化应激PCR Array用人源氧化应激PCR Array检测84种氧化相关基因的表达。

用RNeasy Mini Kit 将HUVECs的总RNA提取，用UNIC 2800 UV/VIS 分光光度计检测波长为260nm 和280 nm时的吸光度，从而评估RNA 提取物的量。

用RNase-FreeDNase Set纯化总RNA，并用RT2 Fist Stand Kit进行逆转录反应，获得cDNA，使用RT2 SYBR GreenROX qPCR Mastermix 进行PCR 反应。

用ABIPrism SDS 7300 system进行热循环。

用Ct值比较不同组的基因表达，所得数值用△△Ct 法计算（将五种常见基因（ACTB、B2M、GAPDH、HPRT 和RPL13A）的平均表达水平正态化。

Real-Time PCR如先前描述的那样，用RNeasy Mini Kit 将HUVECs的总RNA提取，用分光光度计检测RNA提取物的量。

将总RNA 用PrimeScript RT ReagentKit 和gDNA Eraser 转录。

用Real-Time PCR 和SYBR Premix Ex Taq 检测cDNA。

用ABI Prism SDS7300 system进行热循环。

如先前描述的那样，用Ct值比较不同组的基因表达。

Western Blotting加药后收集细胞，并在RIPA 缓冲液裂解细胞。

每条带25 μg蛋白负载至SDS-PAGE 胶上，转膜至硝化纤维素膜。

随后封闭膜，用靶蛋白（β-actin、Nrf2、Keap1、GCLM、NQO1 和HMOX1）相对应的抗体检测，并用合适的二抗孵育2h。

加染色溶液混合物，曝光后检测免疫反应条带。

数据分析数据用平均值±标准差表示，并用t 检验分析数据。

P<0.05 表示数据有显著差异。

三组间数据的比较用单因素ANOVA 分析，qPCR 结果用非参数Mann-WhitneyU数据检测法分析。

以上的分析过程用SPSS 软件操作。

结果H2O2可剂量依赖性诱导细胞毒性用不同浓度XXT处理HUVECs 细胞4 h，并检测氧化应激。

结果表明：加H2O2会导致剂量依赖性氧化应激。

加0.2 mM 后会使细胞数量减少51.74%（图1）。

因此此浓度可以作为HUVECs 用H2O2处理后的IC50。

XXT 对H2O2 诱导的HUVECs氧化应激的作用H2O2 处理后的HUVECs细胞存活率显著下降。

XXT可抑制存活率下降（图2）。

结果表明：和Model组相比，浓度为25~400 μg/ml 的XXT 可促进细胞增殖，阻止H2O2 诱导的HUVECs细胞存活率的下降，但过高浓度的XXT可导致细胞损伤。

XXT对ROS的作用ROS的形成和氧化应激有关。

与NC 组相比，H2O2处理后的HUVECs中ROS 水平升高至118.26%（图3）。

XXT 预处理后，ROS水平显著降低，表明：XXT 在H2O2 诱导的HUVECs氧化应激中扮演重要角色。

XXT诱导氧化应激相关基因的差异性表达本试验用人源氧化应激PCR Array检测Model组和100 μg/ml XXT 处理组的细胞中84种氧化应激相关基因的表达。

加XXT后，20种基因上调（倍数变化≥2），18种基因下调（倍数变化<0.5）。

其中，8种基因显著上调，9种基因显著下调。

XXT对HUVECs Nrf2基因及其下游激活基因mRNA表达的作用为了研究XXT对Nrf2及其下游活化靶基因的转录调控是否有影响，本试验采用qPCR。

当与模型组相比，50、100、200 μM 的XXT可分别诱导Keap1 活性升高3.53、4.2、5.21 倍（图4），也可分别诱导Nrf2活性至2.87、3.2和3.76（图4）。

Nrf2下游调控的转录基因HMOX1、GCLM 和NQO1 的表达也显著提高（图4）。

XXT 对HUVECs 的Nrf2基因及其下游激活基因蛋白表达的作用为了研究抗氧化基因的激活是否受Nrf2信号通路控制，本试验采用Western Blot研究这些基因的表达水平。

Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1这些基因与氧化应激有关，因此本试验检测H2O2处理后的HUVECs中这些蛋白的表达。

结果表明：这些蛋白的表达上调。

与Model组相比，XXT 诱导了Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM 和NQO1的显著表达。

通常情况下，新合成的Nrf2 在细胞质中与Keap1 结合，形成Nrf2-Keap1 二聚体。

Keap1是一种可抑制Nrf2信号的细胞浆蛋白，它能通过蛋白酶通路降解Nrf2。

当氧化物（例如ROS）与Keap1 中的半胱氨酸残基反应，Nrf2 从Keap1 释放，从而进入细胞核。

在核中，Nrf2与Maf蛋白形成二聚体，结合到ARE（位于Ⅱ期抗氧化基因的启动子区域），诱导ARE 调控基因的转录。

Nrf2保护细胞免受氧化应激影响的作用主要通过提高解毒代谢酶的表达、产生抗氧化酶以维持氧化应激稳态。

加XXT后，XXT可通过抑制ROS水平，提高Keap1、Nrf2及Nrf2调控基因的表达，发挥抗氧化、保护血管内皮细胞的活性。

讨论ROS被认为在细胞正常生存信号通路中扮演重要角色，且与细胞毒性相关。

氧化应激因ROS产出量与可抵御ROS、修复损伤的内源抗氧化作用之间的失衡而导致。

ROS可导致大范围的、不加选择的细胞损伤，通常这种细胞损伤可由解毒活性降低或者ROS水平升高引起。

H2O2是一种主要的ROS类型，能快速通过细胞膜，产生不同类型的高度有害的ROS（包括羟基）。

因此，我们检测XXT对HUVECs中H2O2诱导产生的氧化应激和ROS的作用。

结果表明：0.2mM H2O2能有效刺激ROS的释放，导致HUVECs 出现氧化应激（图1和图3）。

在中国，XXT 用于保护心脏、治疗脑血管疾病。

与先前文献报道一致的是，本试验结果表明：XXT可强烈抑制血栓，因此保护血管内皮细胞和维持抗氧化活性。

本课题组先前试验结果显示：XXT能改善体内血液流变学异常，防止血瘀和大鼠的急性血瘀，也可增加血浆中NO 和NO 合酶的水平。

XXT的作用机制可能和细胞周期G0-G1期的解除封闭有关，而这作用机制受H2O2 影响。

但是，XXT 的作用机制和准确的靶点尚未明晰，需要进一步研究。

本试验表明：25~400μg/ml的XXT可促进细胞增殖，但是如果XXT的浓度超过这范围会导致氧化损伤和细胞凋亡。

因此，我们选择浓度为50、100和200 μg/ml 的XXT 进行后续试验。

随后，我们检测了XXT 对H2O2 诱导的HUVECs氧化应激和ROS水平的作用。

XXT（50、100 和200 μg/ml）的预处理显著提高细胞存活率，减少H2O2诱导的ROS分泌（图3）。

所以，XXT的治疗活性可能与其抗氧化活性有关，尽管准确的XXT作用靶标或者信号通路仍需进一步研究。

氧化应激相关基因的PCR array 分析结果可检测XXT的作用机制。

结果表明：8种基因显著上调，9种基因显著下调。

本试验表明GCLM、NQO1、HMOX1和GPX6基因表达受转录因子Nrf2调控。

细胞有高度调控的防御机制，包括氧化应激敏感Nrf2 通路。

大量证据表明：多种药物可通过激活Nrf2 信号通路、上调抗氧化基因，保护细胞和心脑血管系统远离氧化损伤。

因此，本试验研究XXT的抗氧化活性。

ROS水平可通过负反馈循环影响很多氧化调控相关基因的表达。

研究最热的基因表达调控体系之一的便是转录因子Nrf2。

通常情况下，Nrf2和其抑制因子Keap1（包含多种有活性的半胱氨酸残基）结合。

当受到不同刺激（例如氧化应激和特定的抗氧化物）时，Keap1两个半胱氨酸残基被修饰，Keap1-Nrf2 复合体解离，Nrf2从细胞质转移至细胞核。

在细胞核中，Nrf2与小Maf蛋白形成二聚体，共同结合在ARE上，引起Ⅱ期解毒酶/抗氧化酶（包括GST、SOD、CAT、GPX、NQO1 和HMOX1）的高表达（图6）。

在本试验中，XXT通过上调Nrf2及其下游基因的表达，抑制氧化应激。