吴怡慧项目二超氧化物歧化酶的生产

杂 以6000r/min离心
蛋
15min
白
搅拌15min
于上清液中加入1/4 倍体积氯仿-乙醇 混合液
纯 化
用凝胶Sephacryl S-200进行纯化
进行超滤浓缩得到 SOD酶
di
san zhang jie
第三章节
1、SOD酶检验的原理 2、实训准备（材料、仪器） 3、SOD酶检验步骤
SOD酶检验原理
（3）10mol/L盐酸溶液
SOD酶检验步骤
一、连苯三酚自养化速率的测定
（1）准备好两只试管，同时加入PH值为8.30的 50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25+-0.5℃的恒温 水浴中保温10min；
（2）其中一只试管加入等体积事先预热好的25℃连苯三酚溶液， 另支试管作为空白管，加入等体积10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入 1cm比色皿中；
使样液中连苯三酚的氧化速度控 制在0.033-0.037D/min，记 录此时样液体积。
（4）根据公式计算出酶活性。
（2）取一支加入事先预热好的 25℃连苯三酚溶液，另支空白 试管再加入10mol/LHCl，迅 速摇匀后倒入1cm比色皿中；
（3）以空白管为参比，在 325nm下每隔30s测1次吸光值， 连续记录3min，调节酶液体积，
SOD酶检验准备
试剂：
仪器：
（1）PH8.30 50mol/L
K2PHO4-KH2PO4缓冲溶液： 25℃下 96.5ml
1mol/LK2HPO4与 3.5ml1mol/LKH2PO4混合后 用水稀释至2000ml
（1）PH计 （2）紫外分光光度计 （3）恒温水浴槽 （4）10ml试管
ห้องสมุดไป่ตู้
（2）0.05mol/L连苯三酚溶液： （5）1cm比色皿 称取3.15g连苯三酚用 0.01mol/L盐酸溶液溶解并定 容至500ml
di
si zhang jie
第四章节
1、注意事项 2、参考文献
注意事项
（1）在破碎细胞时要注意安全， 一定要破碎的彻底；
（2）PH的控制力度很重要，以 及在实验中的温度等；
（3）丙酮分级沉淀操作时，宜 在4~10℃条件下进行，有利 于提高蛋白沉淀效果，保护 酶活性；
（4）要学会正确使用分光光度 计，先预热30min。
吴怡慧项目二超氧化物歧化酶的生产
目 录
Contents
1
酶与SDO酶的基本知识
2 酶的生产工艺与准备
3 SOD酶的检验与准备
4 注意事项
di
yi zhang jie
第一章节
1、酶的基本知识 2、超氧化物歧化酶（SOD）基本知识
酶的基本知识
酶是由生物活细胞产生的具有特殊催化功能的一类生物活性物质， 其化学本质是蛋白质，故也称酶蛋白。
连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色 的中间产物（反应液由黄棕色变为绿色，再变为黄色，这是由于生 成的中间物不断氧化的结果）。在自氧化过程的初始阶段，黄色中 间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在 420nm处有强烈的光吸收，线性时间一般维持4min的范围内。在 有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积 累，通过计算就可以求出SOD的活力。
（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续 记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在 0.068-0.072D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6ul
SOD酶检验步骤
二、酶活性的测定
（1）取两支试管时加入PH值为 8.30的50mol/LK2HPO4KH2PO4缓冲溶液1.5ml，在 25+-0.5℃的恒温水浴中保温 10min，加入等体积酶液；
❖ 主要来源：大蒜蒜瓣（含有丰富的SOD酶）
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er zhang jie
第二章节
1、SOD酶的提取原理 2、实训准备（材料与仪器) 3、酶的生产工艺流程图
SOD酶的提取原理
➢ 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 是一种具有抗氧化、抗衰老、抗 辐射和消炎作用的药用酶。它可 催化超氧负离子(O2-)进行歧化反 应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜 ➢ 有机溶剂沉淀的原理是有 瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有 机溶剂能降低水溶液的介电常数， 较丰富的SOD，通过组织或细胞 使蛋白质分子之间的静电引力增 破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲 大。同时，有机溶剂的亲水性比 溶液提取出来。由于SOD不溶于 溶质分子的亲水性强，它会抢夺 丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 本来与亲水溶质结合的自由水， 破坏其表面的水化膜，导致溶质 分子之间的相互作用增大而发生 聚集，从而沉淀析出。
邻苯三酚自养化法测定酶活力，计算公式：
0.070-供试品溶液速率
单位体积活力（u/ml）=
0.070
供试品溶液稀释倍数
x 反应液总体积 x
x 100%
50%
供试品溶液体积
总活力（U）=单位体积活力x原液总体积
❖ 酶活力单位意义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分 钟制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
实训准备（材料与仪器）
材料：大蒜蒜瓣
仪器：一个石英砂研钵
氯仿-乙醇混合液 冷丙酮 磷酸缓冲溶液 （PH7.8、 0.05mol/L)
离心管 移液管 玻璃棒 塞离心管 离心机
冷冻离心机
SOD酶的生产工艺流程图
称取5g大蒜 蒜瓣 捣碎
加入磷酸缓 冲溶液15ml
(PH7.8 0.05mol/L)
提 再研磨20min 取 直到充分溶解
用于预防，治疗和诊断疾病的一类酶制剂，称为药用酶。早期主 要用于治疗消化道疾病、烧伤及感染引起的炎症等，现已广泛应 用于多种疾病的治疗。
药用酶制备通常有三种方法：直接提取法；微生物发酵法；动植 物细胞培养法
药用酶常用提取纯化方法有：水溶液法；有机溶剂法；表面活性 剂法（应用较少）
超氧化物歧化酶（SOD）基本知识
置于冷冻离心 机以6000r/min
离心15min
弃沉淀取 上清
得到SOD酶沉淀
冷冻 将沉淀置于5ml磷
干燥
酸缓冲溶液中
分
离
持续搅拌15min以 6000r/min离心15
（PH7.8、 0.05mol/ml）
以6000r/min离心15min
min
加入等体积冷丙酮
弃沉淀取上清液
得到粗酶液
除 弃沉淀取上清
参考文献
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、《生化药物生产》课本P49-P57