超氧化物歧化酶(SOD)的生产

超氧化物酶（SOD）的生产
SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。

对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938
年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。

1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。

它催化如下的反应：202+2H+→H2O2+O2
O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。

它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。

SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。

尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害
的水。

这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。

一、实验目的
a．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。

b．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。

二、实验原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。

同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。

三、实验器材
研钵，石英纱，烧杯(50ml)，玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管。

四、试剂和材料
新鲜蒜瓣，0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.8)，氯仿－乙醇混合液(氯仿：无水乙醇＝3:5)，丙酮(用前预冷至－10℃)。

五、操作步骤 (整个操作过程在0～5℃条件下进行)
a．SOD酶的提取
称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8、0.05mol/L 的磷酸缓冲液(pH7.8)15ml，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲溶液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。

b．去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合液搅拌15分钟，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。

c．SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。

冷冻干燥后即得成品。

对成品进行称量并测定酶活力。

六、提取、提纯方法：
本实验涉及一种从生物体内提取超氧化物歧化酶的工艺制备方法。

该方法的制备步骤为：将活蚯蚓洗净，湿磨，得到的蚓汁经过冷冻、在缓冲液中匀浆、搅拌，离心，弃沉淀物得清液；上述清液进行加热，冷却，过滤后滤液中加入丙酮，沉淀物用缓冲液溶解，弃沉淀物得上清液；上清液在搅拌下加入mg、Cu、Zn，然后离心，弃去沉淀，向上清液中加入硫酸铵溶液，离心收集沉淀；将上述沉淀溶解在缓冲液中，接着透析至无SO2-4，透析液最后上层析柱收集洗脱液，浓缩、冷却、干燥，即得蓝绿色的Cu、ZnSOD。

七、检验与纯度分析：
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。

本实验采用邻苯三酚自氧化方法。

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。

这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。

当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。

酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

1、试剂
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。

（2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

（4）SOD样液
2、器材
（1）恒温水浴槽
（2）紫外分光光度计
（3）试管、刻度吸管、微量注射器
[方法和步骤]
1、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。

要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

2、SOD样液的活性测定
样品管取代自氧化管。

样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。

其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。