超氧化物歧化酶的生产

项目二超氧化物歧化酶的生产

超氧化物歧化酶（英语：Superoxide dismutase，简称SOD）是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。

SOD的概况：

1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念：

超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。

2.SOD的分类

按其结合的金属离子（即金属辅基的成分）可分为：

（1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子内所含金属离子Mn2+）

（3）Cu-Zn-SOD（铜．锌超氧化物）

3.SOD的生产：

仪器、试剂和材料：

-研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管

-新鲜蒜瓣

-0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：5），丙酮（用前预冷至-10℃）。

操作步骤：

整个操作过程在0到5℃条件下进行。

（1）SOD酶的提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎细胞后，加入0.05mol/L的磷酸缓冲液（Ph7.8）15ml，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。

（2）去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。

（3）SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000/min离心15min，得到SOD酶沉淀。

（4）将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。

（5）用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量

（6）将浓缩冷冻干燥后即得成品。

4.SOD酶的检验：

原理：连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。

所需溶液的配制：

（1）pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液：25℃下96.5mL 1mol/L的LK2HPO4与3.5mL 1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀释至2000mL。

（2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500mL。酶活性的测定：

（1）连苯三酚自氧化速率的测定

在10ml试管中加入pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25±0.5℃的恒温水浴中保温10min，然后加入在25±0.5℃的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚溶液（空白管用10mmol/L HCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm 下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6µ1。

（2）样品活性测定

在10ml试管中加入pH为8.30的4.5ml50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和一定体积的样液，在25±0.5℃的恒温水浴中保温10min，然后加入在25±0.5℃的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚6µ1，（空白管用10mmol/L HCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节样液体积，使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，记录此时样液体积。

SOD使用及生产时的注意事项

1.SOD的安全性

大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。

2.SOD生产时的注意事项

（1）在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底

（2）PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等

（3）要学会正确使用分光光度计

紫外分光光度法测定蛋白质含量：本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

拓展：

超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。基本功效：

抑制心脑血管疾病，抗衰老，防治自身免疫性疾病，肺气肿，辐射病及辐射防护，老年性白内障，抗氧化，预防慢性病，抗疲劳，消除副作用，避免二次伤害，化解女性的危机。SOD属于人体内自身就含有的一种抗氧化酶，（如蛋白酶、唾液淀粉酶等都属于酶类），而抗氧化剂是一种单线补充。酶参与人体化学反应，所有的新陈代谢都有酶类参与，所以他的起效和吸收是建立在人体化学反应上的，而抗氧化剂真正生物利用率低，需要在体内进行转化后才能被人体吸收利用，所以相同剂量的酶和抗氧化剂，酶的效果高于抗氧化剂的1000倍以上。SOD，可去除氧自由基，保护皮肤，减缓衰老。但是SOD本身是活性极高、易变性的物质。姑且不算SOD的分离和提取，单保存SOD，设备投入也得在10万元以上。提取SOD本身的技术含量比较高，对原料、生产环境、设备与工艺的要求都非常严格，一套