有机磷酸酯类中毒及解救实验指导

有机磷酸酯类中毒及解救

一、实验目的

1.了解有机磷农药中毒时的症状及产生机制

2.观察解磷定对有机磷酸酯类中毒的解救作用

3.掌握动物给药，血样采集，和紫外分光光度计的操作要点

4.学习胆碱酯酶活力的测定方法

二、实验原理

有机磷酸酯类为持久性抗胆碱酯酶药，中毒后导致乙酰胆碱在体内大量蓄积，导致胆碱能神经过度兴奋，产生M样症状、N样症状和CNS样症状，联合应用阿托品和解磷定类药物可缓解此类症状，其中阿托品为M受体阻断剂，可迅速解除M样症状及部分中枢神经系统症状，但由于不能使胆碱酯酶复活，故对消除肌肉震颤无效。而解磷定为胆碱酯酶复活药，可与有机磷酸酯类形成磷酰化解磷定，使胆碱酯酶复活，从而缓解M症状、N症状（包括肌肉震颤）及CNS症状。

乙酰胆碱在血液中被胆碱酯酶水解，产生乙酸和胆碱。在一定条件下，水解乙酰胆碱的量与胆碱酯酶的活性成正比。故在反应体系中，加入定量的乙酰胆碱使之参加反应，通过测定剩余的乙酰胆碱即可计算出水解的乙酰胆碱量，从而推算出胆碱酯酶的活性。

三、实验动物

家兔两只

四、实验器材、仪器与药品

实验器材与仪器：试管架、食管、量筒、烧杯（采血过滤用）、移液器、注射器、直尺（测瞳用）、动脉夹、手术刀片、棉球、分光光度计、恒温水域锅实验药品：5%敌百虫、0.1%阿托品、2.5%解磷定、蒸馏水、7×10-3mol/L乙酰胆碱、1mol/L碱性羟胺、4N盐酸、3.5N氢氧化钠、0.37mol/L三氯化

铁、Ph7.2磷酸盐缓冲液

五、实验步骤

第一部分：有机磷酸酯类中毒及解救

1.取家兔两只，标记，称重，观察并记录活动情况、呼吸频率、瞳孔大小，唾

液分泌，大小便，有无肌震颤等，将观察结果记录于表1。

2.采血方法：用酒精棉球轻轻擦拭家兔耳缘静脉，当其充血明显时，用刀片横

断耳缘静脉，使血液0.5~1.0毫升自然流入到采血杯中，杯内预先滴入两滴肝素，自然干燥后备用，并轻轻振荡采血杯，防止凝血。

3.按步骤二所述方法取甲乙两兔耳静脉血各一份，用以测定家兔正常胆碱酯酶

活性。

4.分别给甲乙两兔耳缘静脉静脉注射5%敌百虫75mg/Kg，1.5 ml/Kg，按前述指

标观察并将结果记入表一。

5.待中毒症状明显时，按步骤二所述方法再次采血，用于测定家兔敌百虫中毒

后胆碱酯酶活性。

6.甲兔立刻静脉注射0.1%阿托品1mg/Kg，1ml/Kg。乙兔立即静脉注射2.5%解

磷定100mg/Kg，4ml/Kg，观察甲乙两兔的中毒症状有何变化，并将结果记入表一。

7.在症状改善明显时，按步骤二所述方法第三次采血用于测定家兔应用解救药

后胆碱酯酶活性。

第二部分：胆碱酯酶活性的测定

1.加样方法，试剂，顺序及加样体积参照上表

2. 取试管12支，六个一组，分为两组，分别标记为甲1、甲2、甲3、甲4、甲5、甲6、乙1、乙2、乙3、乙4、乙5、乙6。

3. 按表在试管中加入相应体积的pH7.2磷酸缓冲液。

4. 按表在试管中加入相应体积的全血。

5. 混匀后在37±0.5℃恒温水浴中预热3~5分钟。

6. 按表在试管中加入相应体积的7×10-3mol/L 乙酰胆碱溶液。

7. 按表在试管中加入相应体积的蒸馏水。

8. 震荡混匀后于37±0.5℃水浴中反应40分钟，每隔十分钟振摇一次。

9. 配制碱性羟胺溶液：1mol/L 盐酸羟胺溶液与3.5N NaOH 溶液等容混合，并不时振荡。

10. 按表在试管中立即加入碱性羟胺溶液并充分震荡。

11. 按表在试管中立即加入4N 氯化氢溶液并充分震荡。

12. 按表在试管中立即加入0.37mol/L 三氯化铁溶液并充分震荡。

13. 上述反应液用滤纸过滤，将滤液倒入1.0ml 的比色杯中。以530纳米的波长比色，记录光密度值A ，计算全血胆碱酯酶活性值及酶活性值的百分数

六、结果记录

1. 酶活性值的计算

全血胆碱酯酶活性值=

A1、A2、A3和As 分别为对照管1、2、3和样品管的光密度值。A3-A1为单纯ACh 全量的光密度值，A2-A1为血液的光密度值，A3+（A2-A1）为ACh 、血液和试剂的光密度值，A3+（A2-A1）-As 为分解的ACh 的光密度值。

2. 酶活性值的百分数计算

酶活性值的百分数=（样本全血胆碱酯酶活性值）/（正常全血胆碱酯酶活性值）*100%

六、注意事项

1. 用直尺测瞳孔时，注意与瞳孔之间保持1cm 的距离

7*A1-A3As -）A1-A2（+A3

2. 测量瞳孔时，注意前后光线应一致

3. 静脉注射敌百虫时，刺激性比较大，注意按好家兔

4. 敌百虫可以从皮肤吸收，手接触后应立即用自来水冲洗，切勿用肥皂，因其在碱性环境中可转别为毒性更大的敌敌畏