双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接.pptx
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称 为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚 合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替 dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能 继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是 到A就终止了。
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由激光发射器产生的激 光束，通过精密的光学系统 后被导向凝胶表面的检测区。 在此，激光束垂直射向凝胶， 同经过检测孔的DNA片段发 生作用，并提供能量激发荧 光发色基团发射出具特异性 波长的荧光。这些荧光通过 聚焦镜集中后传给滤光镜/ 棱镜组件，以便四种碱基产 生的不同标记波长区别开来。 经成像透像最后由高灵敏度 的相机分段收集信号，传送 给计算所分析处理。
1 产生的都是以A结尾的片段:
GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合物 全部平行地点加在变 性聚丙烯酸受凝胶电 泳板上进行电泳，每 组制品中的各个组分 将按其链长的不同得 到分离，从而制得相 应的放射性自显影图 谱。从所得图谱即可 直接读得DNA的碱基 序列。
正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相 似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等 价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源 性为80％一说。
20
序列相似性比较： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜 索和比对。
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一、DNA测序的方法
DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世 纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷 酸链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method）， 是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口， 用同位素标记进行测序。
即可得到测序结果：为GATCCGAT
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3、技术路线：
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
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4、 高通量自动化测序
DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一 方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指 “读片过程”的自动化。
自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双 脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。
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自动化测序原理
自动化测序类似于PCR反应， 但只用一条引物，反应混合物中 含有不同荧光标记的ddNTP与4 种dNTP。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色,而简化为由 1个泳道同时判读4种碱基。产物 条带经过检测仪时给出特定信号， 由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板； 模板用量少，不必克隆；可实现 高通量自动化。
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1. Sanger双脱氧链终止法测序原理
利用DNA聚合酶和 双脱氧链终止物测定 DNA核苷酸顺序的方法， 是由英国剑桥分子生物 学实验室的生物化学家 F. Sanger等人于1977年 发明的。
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基本原理：
✓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子；
✓ 利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和ddNTP的特性， 使ddNTP参入到寡核苷酸链 的3’-末端。因为ddNTP 3’ 不是-OH，不能与下一个核 苷酸聚合延伸，从而终止 DNA链的增长。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
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16
Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： • 手工测序：最大约300 bp； • 自动测序：最大约1200 bp。
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二、序列比对分析
1. 相似性与同源性 • 相似性(similarity)：
是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A 序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量 化的关系。当然可进行自身局部比较。
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• 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白
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同理第二个反应产生的都是以C结尾 的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反 应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列 了.
8
假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产 生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是 ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以 继续延伸, 产生GATCCGAT.
质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者 非同源序列两种关系。而Hale Waihona Puke BaiduA和B的同源性为80 ％都是不科学的。
19
序列的相似性和序列的同源性有一定的关系， 一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序 列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似 性来推测序列是否同源。
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称 为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚 合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替 dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能 继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是 到A就终止了。
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由激光发射器产生的激 光束，通过精密的光学系统 后被导向凝胶表面的检测区。 在此，激光束垂直射向凝胶， 同经过检测孔的DNA片段发 生作用，并提供能量激发荧 光发色基团发射出具特异性 波长的荧光。这些荧光通过 聚焦镜集中后传给滤光镜/ 棱镜组件，以便四种碱基产 生的不同标记波长区别开来。 经成像透像最后由高灵敏度 的相机分段收集信号，传送 给计算所分析处理。
1 产生的都是以A结尾的片段:
GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合物 全部平行地点加在变 性聚丙烯酸受凝胶电 泳板上进行电泳，每 组制品中的各个组分 将按其链长的不同得 到分离，从而制得相 应的放射性自显影图 谱。从所得图谱即可 直接读得DNA的碱基 序列。
正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相 似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等 价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源 性为80％一说。
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序列相似性比较： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜 索和比对。
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一、DNA测序的方法
DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世 纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷 酸链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method）， 是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口， 用同位素标记进行测序。
即可得到测序结果：为GATCCGAT
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3、技术路线：
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
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4、 高通量自动化测序
DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一 方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指 “读片过程”的自动化。
自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双 脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。
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自动化测序原理
自动化测序类似于PCR反应， 但只用一条引物，反应混合物中 含有不同荧光标记的ddNTP与4 种dNTP。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色,而简化为由 1个泳道同时判读4种碱基。产物 条带经过检测仪时给出特定信号， 由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板； 模板用量少，不必克隆；可实现 高通量自动化。
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1. Sanger双脱氧链终止法测序原理
利用DNA聚合酶和 双脱氧链终止物测定 DNA核苷酸顺序的方法， 是由英国剑桥分子生物 学实验室的生物化学家 F. Sanger等人于1977年 发明的。
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基本原理：
✓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以 区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子；
✓ 利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和ddNTP的特性， 使ddNTP参入到寡核苷酸链 的3’-末端。因为ddNTP 3’ 不是-OH，不能与下一个核 苷酸聚合延伸，从而终止 DNA链的增长。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
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Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： • 手工测序：最大约300 bp； • 自动测序：最大约1200 bp。
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二、序列比对分析
1. 相似性与同源性 • 相似性(similarity)：
是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A 序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量 化的关系。当然可进行自身局部比较。
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• 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白
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同理第二个反应产生的都是以C结尾 的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反 应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列 了.
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假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产 生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是 ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以 继续延伸, 产生GATCCGAT.
质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者 非同源序列两种关系。而Hale Waihona Puke BaiduA和B的同源性为80 ％都是不科学的。
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序列的相似性和序列的同源性有一定的关系， 一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序 列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似 性来推测序列是否同源。